不同产地祖师麻药材中祖师麻甲素的含量测定

王二兵(太原科技大学化学与生物工程学院，太原 030021)

祖师麻为瑞香科植物黄瑞香(Daphne giraldii Nitsche)、陕甘瑞香(Daphne tangutica Maxim).和凹叶瑞香(Daphne retusa Hemsl).的干燥根皮与茎皮。民间广泛用于治疗疼痛、跌打损伤、风湿性关节炎和支气管炎等症，俗称“打得地上爬，离不开祖师麻”［1，2］。且近年来研究发现，祖师麻药材具有多方面的药理作用，如镇痛作用、抗炎作用、对心脏的作用、降压、免疫调节作用、抗缺氧作用、抗缺血再灌注损伤作用、抗菌作用、杀蚜虫作用、抗肿瘤作用、抗疟作用、抗病毒活性、抗肿瘤活性、抗生育活性［3-6］等。祖师麻药材中含有多种有效成分，如瑞香苷(daphnin)［7］、祖师麻甲素(daphnetin)［8］、7- 羟基香豆素(umbelliferone)［9］等。其中祖师麻甲素为其主要的有效成分，因此实验选择测定祖师麻甲素的含量，以比较不同产地祖师麻药材的差别。实验采用了具有检测灵敏、准确、快速、操作简便、重现性好等特点的高效液相色谱法(HPLC)法对祖师麻药材中祖师麻甲素的含量进行了测定。

1 仪器与试剂

Agilent Technologies 1200 series高效液相色谱仪;祖师麻甲素对照品 (购于中国药品生物制品鉴定所，批号为110900-201006);祖师麻药材(共10批，主要是陕西省和甘肃省);甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 检测波长的选择

制备祖师麻甲素的50%甲醇溶液，在200-400 nm波长范围内进行紫外扫描，发现祖师麻甲素在327 nm和260 nm附近均有吸收，其中327 nm波长处吸收较强，故选择327 nm作为祖师麻甲素的检测波长，结果见图1。

2.2 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱;流动相:甲醇 -0.5%冰醋酸溶液(30∶70);流速:1.0 ml/min;检测波长:327 nm;柱温:40℃;进样量:20 μl。理论塔板数按祖师麻甲素计算应不低于2 000。试验表明:在此条件下，基线得以分离，未见明显干扰，祖师麻甲素与其他组分分离良好(见图2)。

2.3 对照品溶液的制备

取祖师麻甲素对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 ml含0.30 mg的溶液，即得。

图1 祖师麻甲素溶液紫外光谱图Figure 1 Ultraviolet spectroscopy of daphnetin solution

图2 祖师麻甲素对照品与祖师麻药材供试品色谱图Figure 2 HPLC of daphnetin control and Chinese traditional herb Zushima

2.4 供试品溶液的制备

取本品粗粉约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇100 ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率25 kHz)45 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得［10-12］。

2.5 线性关系考察

取祖师麻甲素对照品约20 mg，精密称定，置10 ml棕色容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度(2.04 mg/ml)，精密吸取该溶液 5，2.5，1.0，0.6，0.3 ml，分别置于10 ml棕色容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀。在上述色谱条件下分别进样20 μl。以峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X，mg/ml)为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为:Y=-33.102 8+10 503.5 X(r=0.999 9)。结果 表明祖师麻甲素在0.06-2.04 mg/ml范围内具有良好的线性关系。

图3 祖师麻甲素标准曲线Figure 3 The calibration curve of daphnetin in Chinese traditional herb Zushima

2.6 精密度考察

精密吸取祖师麻甲素对照品溶液(C=0.51 mg/ml)20 μl，在上述色谱条件下重复进样6次，测定峰面积，计算精密度，结果RSD(%)=0.72，结果表明:该方法的精密度良好。

2.7 重复性考察

取同一批号的祖师麻药材各约1 g，精密称定，平行制备6份供试品溶液，分别进样20 μl，测得峰面积值，计算相对标准偏差。结果 祖师麻甲素的平均含量为 31.2 mg/g，RSD=1.87%，样品的 RSD 小于3%，说明此方法重复性良好。

2.8 稳定性考察

精密称取祖师麻药材，按含量测定项下方法制备成供试品溶液，分别于0 h，6 h，12 h及24 h进样20 μl，测得峰面积值，计算相对标准偏差。结果 RSD(%)=1.54。表明在试验条件下，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 回收率试验

取6份已知含量的本品适量，精密称定，将一定量祖师麻甲素对照品，分别加入6份供试品中，按供试品溶液制备项下操作，用上述试验条件进行HPLC分析，计算回收量，并以下列公式计算回收率，结果见表1。回收率(%)=(测得量-取样药材中祖师麻甲素的量)/添加对照品量×100%。

由表1结果可知，回收率在95%-105%之间，RSD小于5%，表明方法准确度良好。

2.10 含量测定

取10个批次的祖师麻药材，每批样品平行处理2份供试品溶液，依法测定，结果显示，不同产地祖师麻甲素不同(见表2)。

表1 祖师麻药材供试回收率测定结果Table 1 Recovery test results of Chinese traditional herb Zushima

表2 10批样品的含量测定结果Table 2 Contents of daphnetin in 10 batches of Chinese traditional herb Zushima

3 讨论

在供试品溶液的处理中，曾考察过40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、50%乙醇、60%乙醇等作为提取溶剂，结果表明50%甲醇提取效率最高。也考察了不同超声提取的时间(30 min，45 min，60 min)，经对比发现，超声提取 45 min后，随着超声时间的增加，祖师麻甲素的含量几乎无变化，所以超声时间选为45 min。另外考察了不同的提取溶剂量(40 ml、60 ml、80 ml、100 ml)，结果表明100 ml的甲醇溶液提取效果最好。所以最终确定了供试品溶液的处理方法为:50%的甲醇80 ml超声提取45 min。

从以上的的实验结果可以看出，不同产地的祖师麻药材，其有效成分祖师麻甲素的含量范围为2.11%-4.46%。因此不同产地的祖师麻药材，其药用功效可能相同，但作为处方药时，投料前应严格检查祖师麻甲素的含量，祖师麻甲素含量较低的祖师麻药材，建议不作为药材使用。

［1］ 江苏新医学院.中药大辞典:下册［M］.上海:上海人民出版社，1977:1739.

［2］王明时，于明，张元君.祖师麻化学成分的研究［J］.中草药通讯，1976，7(10):13.

［3］刘国卿，王秋娟，杨思新，等.祖师麻甲素的药理研究［J］.中草药通讯，1977，8(3):21.

［4］张薇，柳润辉，张川，等.瑞香属植物化学成分及其药理与临床作用的研究［J］.药学进展，2005，29(1):22-27.

［5］张明发，沈雅琴.祖师麻甲素的抗整体小鼠缺氧作用［J］.天然产物研究与开发，1994，6(3):21-23.

［6］姜秀莲，曲淑岩，潘光，等.祖师麻甲素对中枢神经系统的抑制作用［J］.中药通报，1986，11(3):封二.

［7］王明时，于明，张元君.祖师麻化学成分的研究［J］.中草药通讯，1976，7(10):13.

［8］任春青，尹斌.中西医结合治疗类风湿性关节炎［J］.医药论坛杂志，2010，31(12):102-103.

［9］ 王明时，玛莱娜·戈加泽.祖师麻化学成分的研究(第二报)［J］.中草药，1980，11(2):49.

［10］刘冰，吕曙华，吴贵华，等.高效液相色谱法测定祖师麻药材中祖师麻甲素［J］.中草药，2010，41(5):832-834.

［11］汤迎爽，康阿龙.高效液相色谱法测定祖师麻叶中祖师麻甲素含量［J］.中国药业，2012，21(12):22-23.

［12］盛华刚.祖师麻中香豆素类成分的提取工艺研究［J］.山东中医药大学学报，2012，36(4):354-356.