基于磷酸化组蛋白H2AX的酶联免疫检测方法评价卷烟烟气基因毒性

付立伟+陈欢+杨进+侯宏卫+胡清源

摘 要 基于酶联免疫原理，建立了定量测定细胞中磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）含量的新方法，并用于评价卷烟烟气的基因毒性。采用不同剂量的烟气气相物与烟气粒相物暴露于中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞），通过测定不同染毒时间下细胞中γH2AX含量水平变化，考察烟气染毒与细胞DNA损伤的剂量效应关系， 以及不同烟气组分基因毒性的差异。此外，通过定量监测细胞中活性氧的变化，探讨卷烟烟气暴露诱发细胞DNA双链断裂损伤的作用机理。结果表明， 随烟气暴露时间的增加，细胞中γH2AX的含量在几小时内达到峰值，然后逐渐下降；染毒浓度越高，细胞中γH2AX含量达到峰值的时间越长；随着烟气粒相物或气相物染毒浓度的增高，细胞中γH2AX含量水平呈上升趋势；烟气粒相物染毒相比烟气气相物对细胞中γH2AX含量的影响更为显著；此外，烟气成分直接染毒会引起细胞内活性氧的含量增加。细胞内活性氧的含量变化与细胞DNA双链断裂标志物γH2AX的含量变化有较强相关性，卷烟烟气中自由基成分可能是诱发细胞DNA双链断裂的原因之一。

关键词 磷酸化组蛋白H2AX；酶联免疫方法；基因毒性

1 引 言

H2AX是组蛋白2A家族成员之一，在 DNA双链断裂（DNA double stranded breaks，DSBs）修复中起主要的信号传输作用。当细胞发生DSBs后，H2AX的丝氨酸残基可以被毛细血管共济失调突变基因（Ataxia telangiectasia mutated，ATM）和DNA依赖性蛋白激酶（DNA dependent protein kinase，DNA PK）等磷酸化，形成磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）[1～3]。γH2AX迅速在DSBs位点簇集，且γH2AX的形成与双链断裂的数量成正比[4]，从而使γH2AX成为DNA损伤/双链断裂的重要的特异性生物标志物。烟气中某些组分（如自由基）能直接作用于细胞中DNA[5]，或通过活化多环芳烃（例如苯并芘）生成多环芳烃DNA加合物[6]，最终导致各种形式的DNA损伤。其中，DNA双链的断裂被认为是最严重的DNA损伤，DSBs修复失败可触发细胞凋亡，甚至破坏DNA信息，继而导致突变、癌症和遗传损害。因此，基于γH2AX这一特异性生物标志物检测卷烟烟气暴露引起的细胞DNA损伤，尤其是DSBs，将有助于评价卷烟烟气的基因毒性。Albino等[7]通过荧光显微镜观测发现，经过烟气冷凝物暴露后细胞内γH2AX的荧光焦点数量增多，且与暴露剂量呈正相关；此外，Toyooka和Ibuki[8]检测出细胞中γH2AX含量与烟气暴露呈现剂量效应关系。其采用的荧光显微镜方法可以获得单个细胞中γH2AX的焦点数量，但使用人工计数，通量低，且无法避免检测过程的主观性。酶联免疫方法（ELISA）具有操作简单快速，通量高，灵敏度高的优势[9]。本研究基于ELISA原理，建立了一种定量测定细胞中γH2AX含量的新方法，并用于考察不同的烟气组分染毒、染毒时间、不同染毒剂量条件下，细胞中γH2AX含量水平变化。同时检测细胞中的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），分析DNA损伤与活性氧的关系，探讨烟气自由基成分对细胞DNA双链断裂的影响。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

CO2培养箱（Thermo SERIES II WATER JACKET）；倒置显微镜IX7（Olympus IX73）；酶标仪（MD Spectra Max M5）；自动转盘式吸烟机（Bolgwaldt RM200A）。

小鼠抗γH2AX单克隆抗体，兔抗总H2AX（不区分磷酸化）多克隆抗体（美国Biolegend公司）；过氧化辣根酶（Horseradish peroxidase，HRP）标记山羊抗鼠抗体，碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）标记驴抗兔抗体（中杉金桥公司）；磷酸4 甲基散酮（Phosphoric acid 4 methyl ketone，4 MUP，欣百诺生物公司），10 乙酰基 3，7 二羟基吩嗪（10 Acetyl 3， 7 dihydroxy phenazine，ADHP，欣百诺生物公司）；DMEM细胞培养基，胎牛血清（美国Gibco公司）；磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）、胰蛋白酶、聚乙二醇单辛基苯基醚（Triton X 100）、4%多聚甲醛（Solarbio公司）；二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，美国Amresco公司）；活性氧检测试剂盒（碧云天公司）；中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）。

细胞膜通透液：0.5% Triton X 100的PBS缓冲液；封闭剂：2%牛血清白蛋白（Bovine serum adbumin， BSA）溶液；混合一抗溶液：使用前取适量兔抗H2AX抗体和小鼠抗γH2AX抗体混合，用2% BSA溶液稀释至所需浓度；混合二抗溶液：使用前取适量HRP标记驴抗鼠抗体和AP标记羊抗兔抗体混合，用2% BSA溶液稀释至所需浓度；HRP酶底物：用PBS缓冲溶液配制0.2 mmol/LADHP溶液，使用前与等体积的30% H2O2混匀；AP酶底物溶液：用PBS缓冲溶液配制0.3 mmol/L 4 MUP溶液。

2.2 实验方法

2.2.1 卷烟烟气染毒样本的制备 实验流程如图1所示。卷烟样品3R4F参比卷烟于温度（22±1）℃和相对湿度60%±3%条件下平衡48 h。使用转盘式吸烟机在ISO抽吸条件下抽吸卷烟，烟气总粒相物（Cigarette smoke total particulate matter，TPM）用剑桥滤片收集，根据TPM质量加入相应体积的二甲亚砜， 得到最终浓度为10 g/L的TPM标准储备液。使用前在

Symbolm@@ 80 ℃储存。在收集烟气总粒相物的同时将气相物通入装有PBS的吸收瓶（冰浴）中，粒相物收集完毕后，将PBS吸收液定容至与粒相物储备液中DMSO相同的体积，通过0.2 μm 滤膜除菌后，得到最终浓度为10 g/L TPM的烟气气相物（Cigarette smoke condensate，CSC）标准储备液，且必须在制备后30 min内使用。

2.2.2 细胞培养及处理 CHO细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，于37 ℃，5% CO2条件下培养。细胞汇合率70%～80%时，将细胞用0.25%胰蛋白酶消解，培养基重悬制成单细胞悬液后，调节细胞浓度至1×105个/mL，按每孔100 μL接种到96孔板，每组设6个复孔。传代细胞至对数生长期时，弃去培养基，加入100 μL不同浓度梯度的烟气粒相物萃取液或烟气气相物吸收液对细胞进行染毒，同时设立空白对照和阳性对照组。

2.2.3 细胞中γH2AX的测定 （1）细胞固定 染毒后的细胞用PBS洗涤两次，每次5 min，除去染毒溶液。每孔加入100 μL 4%多聚甲醛，室温固定15 min；（2）细胞通透 固定好的CHO细胞用PBS洗涤3次，每孔加入100 μL通透液室温孵育15 min；（3）细胞封闭 PBS洗涤3次，加入封闭液37 ℃孵育1 h； 每孔加入100 μL含有兔抗H2AX抗体和小鼠抗γH2AX抗体组成的一抗混合液，4 ℃过夜；（4）恒温孵育 PBS充分洗涤3次，加混合二抗溶液，在37 ℃恒温培育2 h；（5）荧光检测 PBS洗涤3次，向微孔板中加入75 μL的辣根酶底物，孵育30 min，再加入75 μL碱性磷酸酶底物，孵育30 min后经荧光酶标仪（540 nm处激发， 600 nm处检测； 360 nm处激发，450 nm处检测）测定荧光强度值。本实验在检测目标物γH2AX的同时，对细胞中总H2AX（不区分磷酸化标记）也进行了定量测定。根据目标物γH2AX与总H2AX荧光检测信号的比值确定H2AX的磷酸化程度。

2.2.4 细胞中活性氧的检测 将1×105个/mL细胞以100 μL接种在96孔板，每组设3个复孔。传代细胞至对数生长期时，弃去培养基，每孔加入100 μL 10 μmol/L双氢乙酰乙酸 二氯荧光黄（Dihydrochloride acetyl acid dichloride fluorescent yellow，DCFH DA），37 ℃细胞培养箱中孵育20 min。孵育完成后用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，充分除去未进入细胞内的DCFH DA。每孔加入100 μL不同浓度梯度的烟气粒相物萃取液，同时设立空白对照（只加正常培养基）和阳性对照组。染毒2 h后用酶标仪检测，激发波长488 nm，发射波长525 nm。

3 结果与讨论

3.1 酶联免疫法检测磷酸化蛋白H2AX的原理

本研究建立了细胞DNA损伤标志物磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）的酶联免疫检测方法，原理如图2所示。即采用一种特异性γH2AX抗体及酶标二抗对目标蛋白γH2AX特异性夹心识别。加入酶反应底物后，底物被酶催化为有色产物，可根据颜色反应的深浅实现对γH2AX定量测定的方法。检测γH2AX的同时，加入特异性H2AX抗体及相应酶标二抗对总H2AX特异性识别。检测的总H2AX蛋白包含磷酸化和非磷酸化H2AX蛋白，目的是消除由细胞个数差异引起的信号偏差。计算出γH2AX荧光强度比值（γH2AX荧光强度比值=γH2AX荧光值/（H2AX荧光值-空白值注）， 空白值为不加一抗只加二抗条件下γH2AX与H2AX的荧光比值），减小平行样本荧光检测信号的偏差，从而实现目标物γH2AX的准确定量。

3.2 抗体浓度的优化

酶联免疫法对细胞中γH2AX测定的灵敏度取决于特异性识别的一抗与目标物分子的结合量，其间接影响酶标记的二抗分子对目标分子的特异性识别。为提高检测灵敏度，分别对实验中小鼠抗γH2AX抗体及其对应的二抗浓度进行了优化。由图3A可知， 当小鼠抗γH2AX抗体稀释浓度范围在0.6～1.0 mg/L时，发射波长450 nm处测定的荧光强度最大。因此本实验中选择小鼠抗γH2AX抗体的最佳浓度为0.8 mg/L。图3B所示为使用相同浓度的小鼠抗γH2AX抗体和不同浓度的HRP酶标记的驴抗鼠抗体对相同目标物分析时，在荧光酶标仪上测定的荧光强度值。由图3B可知，当HRP酶标记的驴抗鼠抗体稀释浓度为4～6 mg/L时，发射波长450 nm处测定的荧光强度最大。因此选用的HRP酶标记的驴抗鼠抗体稀释浓度为5 mg/L。

3.3 不同暴露时间对细胞中γH2AX含量的影响

为研究不同暴露时间对细胞内γH2AX含量的影响，采用烟气粒相物分别暴露于CHO细胞。暴露剂量为25，50，100和150 mg/L，每个剂量暴露时间设为0，0.5，1，2，4，8，12和24 h。从图4可见，染毒浓度为25和50 mg/L 的细胞，约暴露2 h，γH2AX含量达到峰值，染毒浓度为100和150 mg/L的细胞分别在4和8 h左右细胞中γH2AX含量达到峰值。γH2AX含量达到最大值后随时间增加整体呈下降趋势。总体上，24 h后高剂量粒相物暴露的细胞内γH2AX的含量仍然高于低剂量暴露水平的细胞。有研究发现， 烟雾提取物暴露细胞可引起细胞DNA双链断裂，γH2AX峰值出现在暴露4 h左右，然后逐渐降低[10]。细胞自身存在DNA损伤修复功能，随着DNA双链断裂的重新连接修复，γH2AX会发生去磷酸化。γH2AX可能通过组蛋白交换的方式，从染色体上解离[11]，或者在去磷酸化酶的作用下恢复为H2AX[12]。细胞中存在DNA损伤修复机制，但修复程度与烟气粒相物暴露浓度有关，不同浓度粒相物暴露可能触发的修复机制不同。

3.4 不同浓度烟气染毒对细胞中γH2AX含量的影响

为考察烟气不同组分和浓度暴露对细胞中γH2AX含量的影响，实验采用烟气气相物及粒相物分别暴露于CHO细胞。暴露浓度梯度为10，25，50，75，100，150和200 mg/L，暴露时间根据前期实验设为4 h。同时设空白对照组（未染毒和不加一抗抗体）。由图5可知，

结果表明，烟气暴露尤其是烟气粒相物暴露能引起CHO细胞内H2AX的磷酸化，且磷酸化程度与暴露剂量呈正相关。有研究证实，γH2AX的形成与DNA双链断裂数量存在一一对应关系[4]，是DNA损伤的重要生物标志物。因此，烟气暴露能造成细胞的DNA双键断裂，且存在剂量效应关系。同时实验发现烟气粒相物暴露对细胞中γH2AX含量的影响明显大于烟气气相物。烟气气相物中具有直接基因毒性的物质，需要进一步体外活化才能造成DSBs，而具有间接基因毒性的物质只能对细胞分裂期造成干扰形成DSBs[13]。因此直接将烟气气相物暴露于CHO细胞可能对细胞中γH2AX含量的影响较小。但烟气粒相物和气相物都是复杂的混合物，有超过150种有毒物质[14]。目前仍无法确定烟气中对形成γH2AX起关键作用的毒性物质。

3.5 活性氧检测

每支卷烟所产生的烟雾中约含有1015个自由基。其中气相中包括烷氧基（RO·）、烷过氧基（ROO·）及烷基（R·）等不稳定自由基，焦油相中则含有高浓度的稳定自由基（如半醌自由基和芳香烃自由基等）[5]。卷烟烟气中的自由基，可诱导细胞产生活性氧直接攻击DNA造成DSBs，或与DNA上的碱基形成加合物，使碱基脱失形成无嘌呤嘧啶（Apurinic/apyrimidinic，AP）位点，从而发生DSBs[15]。为探讨烟气染毒诱发细胞DNA双链断裂的作用机理，本实验采用烟气粒相物和气相物分别暴露于CHO细胞。染毒剂量为0， 10， 25， 50， 75， 100和150 mg/L，暴露时间为0.5， 1， 2， 3和4 h。利用荧光探针双氢乙酰乙酸 二氯荧光黄（Dihydrochloride acetyl acid dichloride fluorescent yellow，DCFH DA）检测活性氧，

这种荧光探针可以自由进入细胞，被细胞内的酯酶水解生成2，7 二氢二氯荧光素（2，7 Dihydro dichloride fluorescein，DCFH），而DCFH不能通透细胞膜，细胞内的活性氧可以将其氧化生成有荧光物质进行检测。结果如图6所示，烟气粒相物暴露的细胞中活性氧含量均有所上升，且随暴露浓度增加，活性氧含量逐渐升高。而气相物暴露后的细胞内活性氧含量随暴露浓度增加也呈上升趋势，但变化并不明显。对比图5和图6可见，相同暴露条件下CHO细胞中ROS的变化趋势与γH2AX的变化趋势相一致。研究表明，烟气粒相物可诱导CHO细胞产生ROS，且随着烟气粒相物剂量的加大，[TS（4][HT5”SS] 图6 细胞中活性氧检测荧光强度与染毒浓度的剂量效应曲线

Fig.6 Dose effect curve of exposure concentrations of CSC and TPM and reactive oxygen species（ROS） in cellsROS的浓度也逐渐升高。烟气粒相物暴露后细胞内ROS和γH2AX含量的变化具有很好的相关性。烟气粒相物中半醌自由基可与DNA碱基特别是鸟嘌呤形成DNA加合物[6]；烟气粒相物中芳香烃自由基参与多环芳烃的氧化，生成的亲电衍生物可攻击DNA，或生成DNA加合物[16]。DNA氧化损伤和DNA加合物是卷烟烟气导致细胞产生DSBs的主要作用机制[17]。因此，烟气粒相物中稳定的自由基可能是DBS的形成原因之一。

4 结 论

基于ELISA原理，建立了一种定量测定细胞中γH2AX的方法，并应用于烟气不同组分基因毒性的评价。通过同时测定细胞中H2AX含量，有效地消除细胞个数差异造成的影响。实验发现，烟气粒相物和气相物暴露CHO细胞，均会造成细胞中γH2AX含量的升高，且存在时间剂量效应关系，但粒相物相比气相物对CHO细胞γH2AX含量的影响更为显著。烟气成分暴露可导致细胞中ROS含量升高。细胞中ROS的变化趋势与γH2AX的变化趋势相一致，烟气粒相物中稳定的自由基可能是DBS的形成原因之一。

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