经皮电针刺激正常人耳甲迷走神经的功能MRI脑效应研究

方继良，洪洋，范洋洋，刘军，马云遥，徐春华，王鸿红，马迎歌，王小玲，刘志顺，朱兵，孔健，荣培晶*

1.中国中医科学院广安门医院放射科脑功能成像研究室，北京 100053

2.中国中医科学院广安门医院针灸科，北京 100053

3.北京中医药大学护国寺中医院针灸科，北京 100035

4.中国中医科学院针灸研究所，北京100700

5.美国哈佛医学院麻省总医院玛蒂鲁斯生物医学成像中心，MA02129，美国

迷走神经刺激术(vagus nerve stimulation，VNS)是近20年来兴起的用于治疗某些顽固性疾病的物理治疗方法，对原发性高血压、糖尿病、药物抵抗型癫痫及抑郁症有一定的疗效，美国FDA先后批准了VNS可作为难治性癫痫及抑郁症的一种可行疗法[1]。此疗法通过手术在颈部放置刺激器，刺激左侧颈部迷走神经干，达到治疗效应。尽管此技术很有前途，但也存在费用高，手术有产生副作用风险，还将会对患者病情产生消极影响[2]。2000年，Ventureyra[3]提出了经皮刺激迷走神经的概念(transcutaneous VNS，tVNS)，通过外耳道刺激产生“迷走神经效应”，国内朱兵课题组近10年来进行了经耳甲迷走神经经皮刺激术系列研究，初步表明对顽固性癫痫、血压调控、血糖改善、缓解失眠、抑郁症状等多种病变有确切疗效，还具有操作简单、成本低廉、安全无创等优点，具有广阔的临床应用前景。但其效应的脑机制尚待阐明[4-8]。

本研究采用fMRI技术，经皮电刺激正常人右侧耳甲部迷走神经分布区，观察包括脑干的全脑血流动力学即时效应，分析脑功能激活区及负激活区的变化。提出耳甲部迷走神经刺激技术调制孤束核-边缘叶脑网络的假说。以此为探讨耳迷走神经刺激术治疗疾病的脑机理打下基础，为耳迷走神经刺激术替代手术植入性迷走神经刺激治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本实验共录入16名健康志愿者，男9名，女7名，平均年龄23.8岁(18～27岁)，均为右利手，受试前3 d无任何药物服用史，身体健康,无神经精神病史及头部外伤史。实验通过了广安门医院伦理委员会批准，实验前每位受试者均填写知情同意书、MRI检查问卷，均无MR扫描禁忌证。

1.2 研究内容

(1)正常人组经皮电刺激耳甲迷走神经的fMRI脑效应；(2)正常人组上耳舟部对照电刺激的fMRI脑效应。

1.3 研究方法

经皮耳迷走神经刺激方法(图1)：参照耳部迷走神经解剖，耳迷走神经支从外耳道后外下方进入耳廓之处的耳甲腔区，解剖学定位为外耳道后外下方，此区在耳穴肾上腺点与气管点交叉的下方，暂命名为“迷走”穴。选取右侧耳甲部及外耳道作为迷走刺激组，耳廓外耳缘中部，即上耳舟部作为对照刺激点。采用电磁屏蔽的铜导线，其远端为自制约5 mm直径圆形锡片电极，用小透明胶条固定两电极，在同一区域内黏贴约相隔2 cm。电磁屏蔽线连接磁共振室门外的华佗牌经皮仪(TENS-200，中国中医科学院针灸研究所与苏州医疗用品厂有限公司联合研制)，其为恒压，电流连续输出，脉冲为连续波，频率为20 Hz，波宽0.2 ms，电刺激强度为患者能耐受而不致产生痛觉的痛阈下电流，此电流在扫描实验前当时测定，一般为4～8 mA。正常人刺激与对照实验顺序为均衡设计(随机录入16例受试者，第一受试者先接受迷走刺激实验，那么下一受试者先接受对照部位刺激实验，同一受试者两次实验间隔7 d)。

图1 耳部经皮试验示意图。红色：迷走刺激区 tVNS 经皮迷走神经刺激；兰色：对照刺激区 stVNS经皮非迷走神经刺激组Fig.1 Auricular point.Red color tVNS:tVNS on ACR.Blue color stVNS:sham tVNS on the superior scapha.

fMRI扫描方法：预先告知受试者试验过程及注意事项，解释经皮电刺激感觉的分类和强度主观评判方法，保证每一受试者得到相同的指令和信息。被试者在恒温(24 ℃)完全休息30 min后，平卧在检查床上，视听封闭条件下闭眼安静时扫描，先采集高清3D解剖像，然后，每个实验部位粘连电极，先试电流量，以能忍受而不产生尖锐性疼痛为度。然后间断通电6 min时行EPI-fMRI扫描，重复任务扫描一次(图2)。

图2 fMRI扫描的刺激模式图。A：不通电；B：通电刺激S1、S2、S3Fig.2 fMRI block design paradigm.A:current off.B:current on S1,S2,S3.

使用GE1.5 T Signa Excite ⅡMRI扫描仪，头部正交线圈。3D解剖T1 FSPGR参数： 矩阵256×192，FOV 200 mm×200 mm,层厚 1.4 mm，反转角15°；EPI- fMRI图像数据的采集参数：TR 2500 ms，TE 30 ms，矩阵64×64，NEX为1，FOV 240 mm×240 mm，层厚3.0 mm，层间距0.5 mm，41层，反转角90°，全脑横断扫描，平行于AC-PC线,包括小脑和脑干，每次扫描前空扫4次。

fMRI试验组块设计(图2)。受试者心理行为反应实时记录：预先测定并记录最大电流量，扫描完成时马上要求受试回答，由实验者记录每一志愿者的感觉及评分。根据美国麻省总院针刺试验针感记录表MASS[9]确定得气感觉，包括：酸痛、压感、酸、沉、胀、热、凉、麻木、麻刺、钝痛，另外也记录尖锐性疼痛和其他不适感。0分为无感觉，1～3分为轻度，4～6分中度，7～9分重度，10分为最大可忍受或不可忍受针感。迷走刺激及对照刺激时，均观察记录每分钟的心率及呼吸频率。感觉数据的统计分析：采用SPSS 19.0软件处理数据。两样本配对t检验比较耳甲部及上耳舟部电流量，配对卡方检验针感频率差异，Wilcoxon Signed Ranks 检验此两组的针感强度变化。fMRI数据处理和分析：采用SPM8图像处理分析软件分析数据，一般线性模型(GLM)方法：预处理包括realignment，normalization,smoothing，ART 技术被用来去除移动及全脑平均信号(http://web.mit.edu/swg/software.htm)。然后行个体及组分析比较。第一级分析包括迷走及对照刺激个体分析。第二级分析包括组分析及组间比较，共包括迷走刺激组、对照刺激组、迷走-对照刺激组。

重点分析感兴趣脑区部位、脑干的孤束核、三叉神经核、边缘叶系统，包括杏仁核(Amyg)、海马回(HP)、旁海马回(ParaPH)；额叶内侧回(BA10/11 medial)，扣带回前部(ACC)、前下部(BA24/32、BA25)、顶叶内侧回(Precuneus，BA7 medial)、扣带后部(BA23，31)。另外还观察体感Ⅰ区、Ⅱ区、岛叶、丘脑、扣带回中部、脑干篮斑核及网状结构、小脑蚓部等。

2 结果

2.1 行为学数据-针刺穴位电流量及针感比较

15名受试者fMRI数据参加分析(1例数据因不全排除在统计分析之外)，平均年龄(23.9±3.5)岁，迷走及对照部刺激电流量为(6.47±0.54)mA、(6.87±0.41)mA，(t=－0.685，P=0.505)， 未见显著性差异。迷走刺激及对照刺激时，心率及呼吸频率均未发现明显异常变化，扫描后询问受试者，均未诉及胸部不适感。

正常人不同耳部两组间电刺激频率相似分布，顺序为麻刺、麻木、胀满、压感、热感、沉重、酸痛、钝痛、凉感；组间比较未见明显差异(P＞0.05)。

电刺激强度两组均依次由高到低的顺序为麻刺、麻木、酸痛、胀满、热感、压感、沉重、钝痛，组间比较未见明显差异(P＞0.05)。

2.2 脑血流动力学变化(BOLD-fMRI信号变化)及其对比分析

正常人经皮电刺激迷走、对照部的脑激活、负激活区域分布及差异(表1，2；图3～5)：16例正常受试者(1例因数据不全，未作纳入分析)。因每次实验均重复扫描一次任务态，每组分别累加得30个组块序列扫描，均纳入迷走及对照组对比分析。

2.2.1 耳甲部迷走刺激的脑功能变化(图3，4)

表2 迷走电刺激与对照组脑效应比较图(15名志愿者，每组30个实验,P＜0.005；体素阈值＞3 voxel )Tab.2 Comparison between signal in tVNS and Sham(30 runs,15subjects,P＜0.005,20 voxel)

负激活区：广泛而较强的负激活脑区。延髓部负激活区相当于左侧孤束核位置；大脑部主要分布于顶上回BA7(precuneus)，前中央回BA4；边缘叶系统：后扣带回BA31、23、29、30，双侧颞极BA38及下颞回BA20，双侧下丘脑、旁海马回，海马和杏仁核，左侧腹内侧前额叶BA10。另外可见于前辅助运动皮层BA6内侧部，小脑。激活区：主要位于左侧体感Ⅱ区，双侧顶叶下回BA40，右颞上回，左侧岛叶前部，额下外侧回BA44、BA47及额极部。

2.2.2 对照部电刺激脑功能变化(图5)

负激活区：中脑右侧三叉神经感觉核、右脑桥核。右顶楔叶、双侧颞极、颞下叶；重要的边缘叶区域：前、中、后扣带回BA24、32、23区。左枕叶BA18区、右前额叶及额上叶、左小脑。 激活区：较广泛而强的激活区，可见于左侧SⅡ、双侧顶下回BA40区、额下回BA46区、右侧额下回BA44区、颞上回BA42区、左侧额中回内侧部BA8、前中央回BA6区外侧部、缘上回BA40。

2.2.3 两组间比较结果(表2)

迷走刺激产生了更强的信号，主要位于右岛叶、右中脑核临近锥体束及黑质部位、右枕叶视区、左颞极、右上额叶BA6、小脑。

3 讨论

近年来，植入性迷走神经刺激术(invasive VNS,iVNS)已成为药物抵抗型癫痫及抑郁症的有效治疗方法[1]。但是，因其需要手术，手术存在一定的风险及不良反应，使其推广受到限制[2]。新近发展的经耳迷走神经刺激技术(tVNS)，在动物及人体实验中，已发现具有iVNS相似的效应[6，8-9]。但是，脑中枢神经通路及其效应上需得到证实，才可能使其发展成为一门临床可能替代iVNS的治疗新技术。

图3 tVNS全脑激活及负激活图 图4 tVNS产生了脑干孤束核明显负激活效应。蓝色为负激活，NTS：孤束核；PCC：后扣带回 图5 对照部电刺激产生了三叉神经中脑核明显负激活效应。蓝色为负激活，1：左侧三叉神经中脑核；2：中扣带回；3：前楔回；5：右旁海马。红色为激活，4：额上回(BA8)Fig.3 Map of tVNS eliciting the deactivation and activation in the brain.Fig.4 tVNS eliciting the deactivation in the nucleus of tract solitary in brainstem.Blue color means deactivation.NTS:nucleus of tract solitary.PCC:posterior cingulate cortex.Fig.5 sham tVNS elicited the deactivation in the nucleus of trigeminal nerve in the mid brainstem.Blue color means deactivation.1:nucleus of trigeminal nerve.2:MCC(middle cingulate cortex).3:precuneus.5:parahippocampus.Red color means activation.4:superior frontal gyrus(BA8).

3.1 经皮电刺激耳部感觉分析

针灸理论及临床实践表明，耳部具有较多的穴位，针刺穴位时产生的得气针感，是一种特别的复合感觉，常包括酸麻胀重等多种成分。在既往的正常人体针研究中，发现不同体部7个穴位对电针针感频率、强度相似，胀满、麻木和酸感最常见和最明显，沉重、压感和麻刺次之[10]。本实验发现耳甲迷走点及耳廓外缘电刺激感觉相似，麻刺、麻木、胀满感最为常见。在神经分布来说，耳甲部以迷走神经、耳大神经分布为主，而耳廓部主要由耳大神经分布，神经分布存在明显的交叉重叠[11]，耳部不同位置具有相似的感觉符合感觉神经生理学原理。电生理研究表明，不同类型的神经纤维传导的主要感觉不同，如酸痛、钝痛、热感主要由慢传导纤维Aδ和C纤维.麻木及麻刺感由 Aβ传导。但也存在部分交叉重叠现象。我们的结果与既往体针研究不同的可能原因：前者为四肢肌肉穴位手针或经皮刺激，肌肉组织肌梭神经传导酸痛感。而我们的实验为耳部穴位的表皮电刺激，对Aβ及皮肤感觉纤维效果较明显，麻刺及麻木较易产生。

3.2 耳针与tVNS联系的神经解剖基础

耳针疗法是祖国医学的重要组成部分，数千年来，已成为具有系统的理论和丰富的临床实践经验的一门学科，但其现代作用机理还不十分清楚。临床经验表明，耳针对人体内脏(脏腑)的生理病理功能的调节作用与针刺对迷走神经的调制效应密切相关，如耳针产生的心脏、肺及支气管，胃肠道的效应明显与迷走神经调节功能重叠。现代解剖学认为，迷走神经在外耳有一分支即迷走神经耳支，主要分布于外耳耳甲区，尽管此部位在耳穴中未包括全部内脏器官穴位点，但集中了主要脏腑的耳穴，如心脏、肺及支气管、胃肠道、内分泌、脑等。示踪显影神经形态学研究表明，迷走神经耳支纤维投射到迷走神经上核、孤束核(nucleus of tract solitary，NTS)，还有纤维投射到三叉神经脊束核(TN，spinal nucleus of trigeminal nerve)。这样，针刺耳甲部的穴位通过刺激迷走神经耳支投射到NTS，之后产生的效应与iVNS效应相似，通过NTS发出的纤维多突触投射到延髓中部网状结构、臂旁核、蓝斑核、杏仁核、下丘脑、额眶回等的结构，对大脑产生弥散性的影响[11]。

3.4 iVNS脑效应的功能成像研究

近20年来，多种脑功能成像技术迅速发展，如PET、SPECT及BOLD-fMRI已成功应用到侵入性迷走神经刺激疗法的脑机理研究中，综合研究表明，iVNS产生了即时及长期的脑区功能变化效应，主要作用于边缘叶系统：海马、旁海马、杏仁核、下丘脑、前扣带回及腹内侧前额叶、双侧眶额皮层等[12-13]。这些变化的脑区关联到迷走神经及其投射系统，与神经精神疾病的发生相关，为iVNS在治疗癫痫及抑郁中的作用提供了初步的神经解剖依据。

3.5 tVNS的fMRI任务态研究

对于耳部tVNS的脑功能成像研究，目前还不多，只局限于fMRI在正常受试者身上进行，初步观察了tVNS在左外耳道的即时脑效应，对tVNS的可行性进行了评估，在使用刺激技术的方法上进行了探讨[14-16]。

既往tVNS的fMRI研究中，Kraus等[14]2007年首次比较左侧外耳道与耳廓中部刺激，在迷走刺激组，发现明显广泛的边缘叶及颞区的负激活区，如双侧杏仁核、旁海马、楔叶、中颞回、后扣带回、左海马；信号增强区为双侧岛叶及前中央回、右丘脑及右前扣带回；在对照组，显示旁中央叶及右旁海马区的信号减低，其他区域显示中央前回及上中额回信号增强。与我们的实验边缘叶负激活相似，但我们直接看到了迷走脑干核团-孤束核及对照刺激三叉神经核的负激活现象。最近，Kraus等[15]又进行了左外耳道前后壁刺激比较研究，发现前壁刺激产生了强烈的蓝斑核及孤束核的负激活效应。Dietrich等[16]采用左侧外耳道刺激4例正常受试者，发现了蓝斑核、丘脑、左后扣带回的激活及伏核的负激活，认为与tVNS抗抑郁及治疗情感相关疾病可能有关。本次实验样本较前文献记载明显增大，达到15人，共计每组30个实验，得到的结果既证实了既往iVNS及tVNS效应脑功能成像相似的结果，前额叶及边缘叶系统明显的负激活，也显示了在脑干部的明显负激活效应，这说明耳甲部与迷走初级中枢孤束核直接相关。

3.6 右侧迷走神经刺激脑功能成像研究的意义

既往VNS治疗的大量基础及临床试验均采用左侧迷走神经刺激。其原因是基于右侧颈部迷走神经干存在较多的支配心血管下行迷走副交感支所致。在猪癫痫模型上，右侧迷走刺激与左侧一样抑制了人工所诱导的脊髓癫痫[17]。在个案报道中，癫痫病人身上也发现右侧迷走刺激iVNS得到了较好的疗效，而未引起明显的心血管副作用[18]。目前，功能影像学研究也只局限于左侧迷走神经刺激，因此，笔者采用的右耳甲部刺激实验将帮助进一步了解了迷走刺激在临床上的可行性，丰富了其机制多角度的研究[19]。

本研究在样本量上虽然较既往研究多，但还是较小；还需采集病人治疗前后的fMRI数据，与临床指标变化作相关分析，从功能影像上揭示其治疗机制。本研究采用fMRI技术，观察到经耳迷走神经刺激产生了与既往植入性迷走神经刺激相似的脑效应如广泛的边缘叶系统负激活，更重要的是，在脑干迷走神经核上观察到了直接的效应。初步证实了我们的假说“迷走神经刺激术调制孤束核-边缘叶脑网络”。

致谢：感谢导师组(朱兵、喻晓春、荣培晶研究员)的指导。

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