阿尔茨海默病患者血浆淀粉样变水平对血液物理指数的影响

兰 杰 薛 蓉 李春芳 宋敬敬 李晓亮 卢 鑫 孙续国

(天津医科大学医学检验学院，天津 300203)

阿尔茨海默病(AD)是老年痴呆的一种常见类型，主要病理学特征为大脑皮质和海马区神经元细胞内外有神经纤维缠结和老年斑块形成，并伴神经突触的丢失以及大脑实质萎缩〔1〕。大量研究发现有多种因素可导致AD患者脑组织血流低灌注〔2～7〕，其中体循环血液流体异常也会导致AD患者脑组织血流低灌注，如全血黏度增加、红细胞变形能力减弱、红细胞聚集性增加等多种血液流变因素均可导致脑组织血流低灌注〔8～10〕。但是AD患者血液淀粉样变状态以及血淀粉样变对于血液流体的影响缺少系统研究。先前本组已建立血液淀粉样变的测定方法〔11〕，本文进一步系统分析AD患者血浆淀粉样变水平，并探讨淀粉样变与血液物理指数的相关性。

1 资料与方法

1.1 资料 AD组:来自天津医科大学总医院神经内科诊治患者30 例，男24 例，女6 例，平均年龄(69.40±8.57)岁，均符合NINCDS-ADRDA中的AD诊断标准。健康对照组:天津医科大学总医院健康检查者30例，男26例，女4例，平均年龄(65±4.4)岁，AD 组与对照组年龄无显著差异(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 血液流变学检测 采集清晨空腹静脉肝素抗凝血8 ml(肝素抗凝采血管，上海卒瑞生物科技有限公司)，4 h内完成实验。采用LBY-N6A自清洗旋转式黏度仪，实验室测定温度27℃，同批血浆淀粉样变测定血液物理指数。

1.2.2 测定血浆淀粉样变6 mol/L ThT溶液与血浆进行反应，20 min，采用FL F-2500荧光分光光度计检测荧光强度，计算淀粉样纤维水平。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹分析(WB)4%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，考马斯亮蓝溶液对蛋白进行染色。免疫印迹实验，鼠抗 A单克隆抗体(Abcam，Cambridge，UK)孵育 60 min，10 mmol/L PBS(pH 7.4)缓冲液洗涤，酶标记二抗体(Abcam，Cambridge，UK)孵育60 min，CE成像。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件，计量资料以s表示，组间比较采用独立资料t检验，相关性分析采用Pearson法。

2 结果

2.1 比较AD患者与对照组血浆淀粉样变水平 利用淀粉样变特异性荧光探针，测定两组血浆中淀粉样变荧光强度，结果AD患者明显高于对照组(P＜0.05)。见表1。

2.2 SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色结合WB分析血浆Aβ蛋白分布 SPS-PAGE及WB分析结果显示大小分子比例未见明显差别，AD患者与对照组均可与Aβ发生免疫反应，分子量170～15 kD，分布与蛋白染色未见明显不同。见图1。

表1 比较AD患者与对照组之间血浆淀粉样变荧光强度及血液物理指数差异(s，n=30)

表1 比较AD患者与对照组之间血浆淀粉样变荧光强度及血液物理指数差异(s，n=30)

?

2.3 淀粉样变荧光强度与血液物理指数之间的相关性 AD患者全血黏度低切(1.00、5.00、3.00 s-1)值(r=0.674，P=0.032;r=0.677，P=0.031;r=0.674，P=0.033)、全血黏度的均值(200S-1，r=0.677，P=0.031)、全血高切相对指数(r=0.737，P=0.015)、全血低切相对指数(r=0.715，P=0.020)与血淀粉样变水平呈正相关，而血细胞比容、红细胞刚性指数、红细胞变形指数TK均未见有明显统计学差异。

图1 血浆蛋白SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝蛋白染色和抗人Aβ抗体Western印迹结果及CE蛋白丰度扫描分析

3 讨论

大量报道ThT能够与淀粉样变纤维结合，其荧光强度能够反映淀粉样变水平，已经广泛应用于测定淀粉样变纤维含量〔12，13〕。本文结果提示AD患者血浆淀粉样变水平增高。提示淀粉样变对于血液流体影响主要体现在血浆部分。

众所周知，AD患者淀粉样变前蛋白为Aβprotein，观察免疫反应能够体现淀粉样变伴随成分。AD患者和对照组均可见Aβprotein分布于血浆的大分子与小分子结合，提示与血浆蛋白结合，实验结果支持淀粉样变影响血液黏度。

综上，AD患者血浆淀粉样变水平明显增高，淀粉样变与血浆成分结合，改变全血流体指数，对于红细胞变形及聚集性未见明显差别，可作为AD患者调节血液流体状态的参考指标。

1 Honjo K，Black SE，Verhoeff NPLG.Alzheimer＇s disease，cerebrovascular disease，and the β-amyloid cascade〔J〕.Canadian J Neurol Sci，2012;39:712-28.

2 Ishii K，Ito K，Nakanishi A，et al.Computer-assisted system for diagnosing degenerative dementia using cerebral blood flow SPECT and 3DSSP:a multicenter study〔J〕.Jap J Radiol，2014;31(1):1-8.

3 Akiyama HS，Barger S，Barnum B，et al.Inflammation and Alzheimer＇s disease〔J〕.Neurobiol，2000;21(3):383-421.

4 Berzin TM，Zipser BD，Rafii MS，et al.Agrin and microvascular damage in Alzheimer＇s disease〔J〕.Neurobiol，2000;21(2):349-55.

5 Buee L，Hof PR，Delacourte A.Brain microvascular changes in Alzheimer＇s disease and other dementias〔J〕.Ann N Y Acad.Sci，1997;826(1):7-24.

6 Grammas P，Ovase R.Inflammatory factors are elevated in brain microvessels in Alzheimer＇s disease〔J〕.Neurobiol，2001;22(6):837-42.

7 Thirumangalakudi L，Samany PG，Owoso A，et al.Angiogenic proteins are expressed by brain blood vessels in Alzheimer＇s disease〔J〕.J Alzheimers Dis，2006;10:111-8.

8 Ajmani RS，Metter EJ，Jaykumar R，et al.Hemodynamic changes during aging associated with cerebral blood flow and impaired cognitive function〔J〕.Neurobiol.Aging，2000;21:257-69.

9 Chen SM，Fan CC，Chiue MS，et al.Hemodynamic and neuropathological analysis in rats with aluminum trichloride-induced Alzheimer＇s disease〔J〕.PLoS One，2013;8(12):e82561.

10 Chang CY，Liang HJ，Chow SY，et al.Hemorheological mechanisms in Alzheimer＇s disease〔J〕.Microcirculation，2007;14(6):627-34.

11 Sun X，Ando Y，Haraoka K，et al.Role of VLDL/chylomicron in amyloid formation in familial amyloidotic polyneuropathy〔J〕.Biochem Biophy Res Comm，2003;311(2):344-50.

12 Groenning M.Binding mode of Thioflavin T and other molecular probes in the context of amyloid fibrils＇current status〔J〕.J Chem Biol，2009;3(1):1-18.

13 Alí-Torres J，Rimola A，Rodríguez-Rodríguez C，et al.Insights on the binding of thioflavin derivative markers to amyloid-like fibril models from quantum chemical Calculations〔J〕.J Phys Chem B，2013;117(22):6674-80.