单侧输尿管梗阻肾间质纤维化大鼠肾组织PHB1和PHB2的表达及意义

雷凤英，陈秀萍，周志强，周添标，黄韦芳，覃远汉，蒋 玲

（1广西医科大学第一附属医院，南宁 530021;2中山大学附属第六医院）

肾间质纤维化（RIF）是多种肾脏疾病慢性进展至终末期肾病（ESRD）的共同病理特征［1］，其主要病理特征为肾间质成纤维细胞增生和包括Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）和纤维连结蛋白（FN）在内的细胞外基质（ECM）的过度积聚［2］。PHB是一种存在于细胞内的抗增殖蛋白，与细胞周期、凋亡与增殖、维持线粒体功能、抗肿瘤等密切相关［3］。前期研究发现，PHB与RIF发生发展密切相关［4］。本研究观察单侧输尿管梗阻（UUO）RIF大鼠肾组织PHB1和PHB2的表达，并探讨其意义。

1 材料与方法

1.1 动物 80只雄性6周龄Wistar大鼠，购于广西医科大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 Wistar大鼠随机分为假手术组和模型组，每组40只。模型组大鼠无菌条件下行左侧输尿管双重结扎术。假手术组大鼠在同样的条件下，仅探及肾包膜，不结扎输尿管。两组大鼠均常规喂养。于术后第2周末和第4周末腹腔麻醉后分别处死20只大鼠，摘除左侧肾脏。分别取1/2肾脏立即用10%中性甲醛固定，用于肾脏病理学检查;另1/2肾脏立即置于液氮冷冻保存，用于实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测。

1.2.2 肾组织病理学检查 常规石蜡包埋肾脏组织，4 μm切片，行Masson染色后，光镜下观察肾脏的病理改变。结果采用DMR加Q550病理图像分析系统（德国Leica公司）进行半定量分析。在400倍下每张切片随机选择5不重叠视野，避开大血管和肾小球，将呈现绿色的纤维区域视为阳性目标，以阳性面积与整个视野总面积的比值作为RIF指数［5］。RIF指数（%）=（纤维化面积/肾小管间质总面积）×100%。

1.2.3 肾组织 PHB1、PHB2、TGF-β1mRNA 测定采用实时荧光定量RT-PCR法。取大鼠冰冻肾脏组织100 mg，按RNA提取试剂盒提取总RNA。步骤参照试剂盒说明书。引物均由上海生物工程公司生产。每个样本重复测量3次，取其平均值为样本Ct值，用 2-△△CT法［6，7］进行 mRNA 相对表达量比较。

1.2.4 肾组织 PHB1、PHB2、TGF-β1、Col-Ⅳ、FN 蛋白检测 采用Western blot法。取大鼠肾脏组织100 mg，在液氮中将肾组织研磨至粉末后，提取总蛋白，测定浓度。总蛋白变性后进行Western blot检测，步骤参照试剂盒说明书。工作液浓度:PHB1:1∶1 000、PHB2:1∶1 500、TGF-β1:1∶2 000、Col-Ⅳ:1∶1 000、FN:1∶2 000。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量资料用±s表示，组间比较采用完全随机设计t检验;采用直线相关分析进行相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾脏病理改变 手术后第2周末和第4周末光镜下假手术组大鼠肾脏无明显病理改变。模型组大鼠手术后第2周末，肾小管和集合管呈囊状扩张，肾皮质区分布大量弥漫性炎性细胞，肾间质面积增宽、肾间质组织纤维化;第4周末肾小管结构出现严重破坏，小管间质明显变宽，肾小管明显萎缩，肾小管上皮细胞（RTEC）出现大量坏死，大量炎性细胞和纤维组织增生。两组RIF指数比较见表1。

表1 两组大鼠肾组织RIF指数比较（±s，n=40）

表1 两组大鼠肾组织RIF指数比较（±s，n=40）

注:与同组第2周末比较，*P＜0.01;与假手术组同时间点比较，△P ＜0.01

组别 RIF 指数第2周末 第4周末假手术组0.78 ±0.10 0.81 ±0.09模型组 24.48±1.33△ 40.59±1.35＊△

2.2 肾组织 PHB1、PHB2、TGF-β1mRNA 检测结果见表2。

表2 两组大鼠肾组织PHB1、PHB2、TGF-β1mRNA比较（ ± s，n=40）

表2 两组大鼠肾组织PHB1、PHB2、TGF-β1mRNA比较（ ± s，n=40）

注:与同组第2周末比较，*P＜0.01;与假手术组同时间点比较，△P ＜0.01

组别 PHB1 mRNA PHB2 mRNA TGF-β1mRNA假手术组第2 周末 1.02 ±0.04 1.00 ±0.06 1.00 ±0.06第4 周末 1.01 ±0.04 0.99 ±0.06 1.01 ±0.05模型组第2周末 0.37±0.03△ 0.30 ±0.05△ 4.28±0.59△第4 周末 0.28 ±0.03＊△ 0.06 ±0.04＊△ 6.75 ±0.63＊△

2.3 肾组织 PHB1、PHB2、TGF-β1、Col-Ⅳ、FN 蛋白检测结果 见表3。

表 3 两组大鼠肾组织 PHB1、PHB2、TGF-β1、Col-Ⅳ、FN 蛋白比较（ ± s，n=40）

表 3 两组大鼠肾组织 PHB1、PHB2、TGF-β1、Col-Ⅳ、FN 蛋白比较（ ± s，n=40）

注:与同组第2周末比较，*P＜0.01;与假手术组同时间点比较，△P＜0.01

组别 PHB1 PHB2 TGF-β1 Col-ⅣFN假手术组第2 周末 0.66 ±0.04 0.88 ±0.05 0.60 ±0.05 0.47 ±0.06 0.36 ±0.05第4 周末 0.67 ±0.05 0.87 ±0.06 0.61 ±0.06 0.48 ±0.07 0.37 ±0.04模型组第2周末 0.51±0.05△ 0.62 ±0.06△ 0.99±0.06△ 0.88±0.04△ 0.90±0.05△第4周末 0.28±0.06＊△ 0.43 ±0.04＊△ 1.34±0.05＊△ 1.22±0.07＊△ 1.18±0.04＊△

2.4 相关性分析结果 大鼠肾组织PHB1蛋白表达与 RIF 指数、TGF-β1、Col-Ⅳ、FN 均呈负相关（r分别为 -0.86、-0.87、-0.70、-0.73，P均 ＜0.05）;PHB2 蛋白表达与 RIF 指数、TGF-β1、Col-Ⅳ、FN 均呈负相关（r分别为 -0.73、-0.81、-0.91、-0.84，P均 ＜0.05）;PHB1蛋白表达与 PHB2蛋白表达呈正相关（r=0.78，P＜0.05）。

3 讨论

UUO大鼠模型是目前研究RIF的经典动物模型。UUO大鼠首先出现肾脏血流动力学改变和代谢改变，继而出现肾小管损伤和RTEC凋亡和坏死，肾间质巨噬细胞和单核细胞浸润，肾间质成纤维细胞和肌成纤维细胞增殖，导致包括FN和Col-Ⅳ在内的 ECM 积聚和 RIF 发生［8，9］。TGF-β1是一种多效因子［10］，是目前公认的强致纤维化因子之一，能刺激成纤维细胞分泌Col-Ⅳ和FN，加剧纤维化，在RIF进程中发挥重要作用。本研究结果显示，模型组术后第2周末和第4周末大鼠肾脏病理改变为肾小管间质变宽，肾小管萎缩，大量炎性细胞浸润和纤维组织增生;与假手术组比较，模型组大鼠术后第2周末和第4周末肾组织RIF指数显著增高，TGF-β1、Col-Ⅳ、FN蛋白表达均增高，与文献报道相符［11］，提示UUO模型构建成功。

PHB是一种结构高度保守的肿瘤抑制因子，广泛分布于真核生物、细菌、真菌、植物及哺乳动物等细胞中，能通过作用于核转录因子E2F使细胞周期阻滞于G1/S期，与细胞凋亡及增殖、维持线粒体功能、抗肿瘤等密切相关［3，12］。PHB 家族包括 PHB1和PHB2，分布并游离在线粒体、细胞核、细胞质膜等部位［12］。在正常肾脏组织中可检测到 PHB表达。Guo等［13］在不同程度肾小管间质损伤儿童肾病的肾脏组织活检中发现，PHB1在损伤的肾小管间质中表达降低，并且其蛋白表达水平与肾小管间质损伤程度呈负相关，同时在体外培养的大鼠成纤维细胞株中过表达 PHB后发现，PHB可以抑制TGF-β1诱导成纤维细胞的增殖和表型改变。Quan等［14］应用质谱分析高尿酸诱导体外培养RTEC损伤的蛋白表达变化，发现损伤的RTEC中PHB2表达显著下调。前期研究发现，UUO大鼠肾脏组织PHB表达与细胞凋亡指数显著相关［4］。

本研究结果显示，UUO大鼠梗阻时间越长，肾脏组织PHB1和PHB2表达越低，RIF越严重。提示PHB1和PHB2表达显著降低，可能参与了RIF的发生发展，但确切的作用机制有待进一步深入探讨。

［1］Farris AB，Colvin RB.Renal interstitial fibrosis:mechanisms and evaluation［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens，2012，21（3）:289-300.

［2］Genovese F，Manresa AA，Leeming DJ，et al.The extracellular matrix in the kidney:a source of novel non-invasive biomarkers of kidney fibrosis［J］.Fibrogenesis Tissue Repair，2014，7（1）:4.

［3］Zhou TB，Qin YH.Signaling pathways of prohibitin and its role in diseases［J］.J Recept Signal Transduct Res，2013，33（1）:28-36.

［4］Zhou TB，Qin YH，Zhou C，et al.Less expression of prohibitin is associated with increased caspase-3 expression and cell apoptosis in renal interstitial fibrosis rats［J］.Nephrology（Carlton），2012，17（2）:189-196.

［5］Yokoi H，Mukoyama M，Nagae T，et al.Reduction in connective tissue growth factor by antisense treatment ameliorates renal tubulointerstitial fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2004，15（6）:1430-1440.

［6］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））Method［J］.Methods，2001，25（4）:402-408.

［7］Chen XP，Lei FY，Qin YH，et al.The role of retinoic acid receptors in the signal pathway of all-trans retinoic acid-induced differentiation in adriamycin-induced podocyte injury［J］.J Recept Signal Transduct Res，2014:1-9.［Epub ahead of print］.

［8］Chevalier RL，Forbes MS，Thornhill BA.Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy［J］.Kidney Int，2009，75（11）:1145-1152.

［9］ Klahr S，Morrissey J.Obstructive nephropathy and renal fibrosis［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2002，283（5）:861-875.

［10］Brophy TM，Coller BS，Ahamed J.Identification of the thiol isomerase-binding peptide，mastoparan，as a novel inhibitor of shear-induced transforming growth factor beta1（TGF-beta1）activation［J］.J Biol Chem，2013，288（15）:10628-10639.

［11］Chaabane W，Praddaude F，Buleon M，et al.Renal functional decline and glomerulotubular injury are arrested but not restored by release of unilateral ureteral obstruction（UUO）［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2013，304（4）:432-439.

［12］Chowdhury I，Garcia-Barrio M，Harp D，et al.The emerging roles of prohibitins in folliculogenesis［J］.Front Biosci（Elite Ed），2012（4）:690-699.

［13］Guo W，Xu H，Chen J，et al.Prohibitin suppresses renal interstitial fibroblasts proliferation and phenotypic change induced by transforming growth factor-beta1［J］.Mol Cell Biochem，2007，295（1-2）:167-177.

［14］ Quan H，Peng X，Liu S，et al.Differentially expressed protein profile of renal tubule cell stimulated by elevated uric acid using SILAC coupled to LC-MS［J］.Cell Physiol Biochem，2011，27（1）:91-98.