元沙沙 黄海霞 杨金奎*
(1.首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科,北京100730;2.糖尿病防治研究北京市重点实验室,北京100730;3.首都医科大学基础医学院生理与病理生理学系,北京100069;4.首都医科大学代谢紊乱相关心血管疾病北京市重点实验室,北京100069)
人ether-a-go-go相关基因(human ether-a-go-go related gene,hERG)编码的离子通道称为hERG通道,属于电压依赖性钾通道(voltage-dependent potassium channel,Kv)家族的一员。目前发现的hERG钾通道家族共有 3 种亚型:hERG1,2,3,或称 Kv11.1,2,3。三者在人体不同组织中表达量不同,发挥的作用也不同。其中hERG1是最早被克隆的hERG家族成员,主要表达于可兴奋组织,如心肌、脑、垂体、胰腺。心肌快速激活的延迟整流钾电流(rapidly activated delayed rectifier potassium current,IKr)主要参与心肌动作电位的复极化突变后导致外向复极钾电流减少,QT间期延长,引发多型性室性心动过速、心源性晕厥和猝死,称长 QT 综合征(long-QT syndrome,LQTS)[1]。脑组织中hERG1,2,3均有表达,其中hERG1主要与神经元兴奋发放频率的适应性有关[2]。Hardy等[3]研究发现在人的胰腺组织也有 hERG1,2,3表达,其中hERG1与维持静息膜电位水平有关,既是胰岛素分泌的负调节因素,又是胰高血糖素分泌的正调节因素。
同是hERG通道家族成员,但hERG1,2,3电压依赖性以及门控特性并不相同[4],其中 hERG1与hERG2特性相似,而与hERG3差异较大。目前对于hERG家族,尤其是hERG1的功能研究较多,而对于hERG2与hERG3亚型的功能研究较少。分析其原因是多数已知表达hERG1,2,3的组织(心脏、脑、胰腺)中,hERG1表达量要高于hERG2与hERG3,采用异源表达的方法只能从基因水平区分各亚型成员,但对于自身组织中表达的hERG1,2,3尚缺乏特异性抑制药物来严格区分。现有的抑制剂如E-4031、Dofetilide,只能作为hERG家族的抑制剂,并不能区分亚型。胃肠动力药西沙比利是治疗胃肠功能紊乱症的常用药物,自1992年已有关于过量胃肠动力药西沙比利可引发长QT综合征和致命性室性心律失常的报道[5-7]出现。Mohammad等[8]根据这一现象,结合hERG1具有参与心肌动作电位的复极化的作用,提出了胃肠动力药西沙比利是一种潜在的hERG(指hERG1)抑制剂的假设,通过在HEK293细胞上稳定表达hERG1通道,并利用膜片钳技术进行了验证。但西沙比利对于hERG2是否也有抑制作用,国内外尚未有报道。本研究初步探讨了西沙比利对于hERG2通道电流的影响,希望为后续研究hERG2电流的特异性抑制剂提供一个可应用的稳定模型。
HEK293细胞购买于协和医科大学细胞库。完全培养基含高糖DMEM溶液(含L-谷氨酸,不含丙酮酸钠),10% 胎牛血清,1% 青-链霉素,1% 丙酮酸钠,0.25%胰蛋白酶均为美国Gibco公司生产。含目的基因hERG2 cDNA(Gene Bank编号AF311913)、标记基因GFP、启动子SV40和CMV、抗氨苄基因的表达载体GV314购于上海吉凯基因公司。Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司。电极内液成分包括:KCl 130 mmol/L,MgATP 5 mmol/L,MgCl21 mmol/L,EGTA 5 mmol/L,HEPES 10 mmol/L(用KOH调节pH 值至7.3);电极外液成分包括:NaCl 137 mmol/L,KCl 4 mmol/L,CaCl22 mmol/L,MgCl21 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,Glucose 10 mmol/L(用NaOH 调节pH 值至7.4);西沙比利(Cisapride Monohydrate以下简称Cisapride,粉末状,药品纯度≥98%,购于美国Sigma公司),用无水乙醇(纯度≥99.7%,京纯试剂)配置为10 mmol/L的存储液,分装于1 mL离心管中,于-20℃冻存,用时按实验所需终浓度稀释于电极外液中。无水乙醇终体积分数不超过0.01%,可认为对hERG无影响。MgATP、EGTA、HEPES、Glucose为美国Sigma公司生产,其余未特殊注明者为国产分析纯试剂。
膜片钳放大器:EPC-10(德国HEKA公司);三维操纵仪:MP-285型(美国Sutter公司);倒置荧光显微镜:TE2000-U型(日本Nikon公司);电极拉制仪:Narishige Model PB-7(日本Narishige公司);玻璃微电极:BF150-110-10型(美国Sutter公司);数据采集软件:Pulse8.8(德国 HEKA公司);数据转换软件:Minianalysis V6.02;数据分析软件:pCLAMP9.2(美国Axon公司);数据处理与绘图软件:Origin8.0(美国Microcal公司)。
HEK293细胞置于5%CO2的37℃培养箱中,72 h传代1次。实验所用细胞为10~40代之内。采用携带目的基因hERG2 cDNA和标记基因GFP的表达载体GV314,该表达载体含有 SV40和CMV启动子、抗氨苄基因。Lipofectamine 2000,转染48~72 h后,用0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞后用HEK293完全培养基重悬,分种于35 mm培养皿中,选取镜下荧光较强的细胞进行全细胞膜片钳记录。
膜片钳实验采用全细胞记录模式。玻璃微电极在充灌电极内液后测得电极电阻2.5~4.0 MΩ,符合全细胞记录使用条件。高阻封接成功后电阻1~2 GΩ。采用负压吸引方式破膜,破膜后电阻500~600 MΩ。实验均在室温25℃ ~28℃条件下完成。
使用Origin 8.0和SPSS 19.0进行统计分析。所有数据均以均数±标准差(±s)表示。两组间数据比较采用两独立样本t检验。多组间数据比较使用单因素方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。
将HEK293细胞膜电位钳制在-80 mV、时长1 s,之后给予-60~+50 mV、时长3 s的系列去极化刺激,阶跃为10 mV,可观察到随电压升高呈现先升高后下降的时间依赖性电流(Step电流,通常测量去极化后期的稳态值来代表),反映hEGR2通道的内向整流性;之后恢复至测试电位-40 mV,时长3 s,引出尾电流,各电压下尾电流峰值的大小反映了该电压下通道开放的程度。比例尺纵轴代表电流幅度500 pA,横轴代表时长1 s。在该刺激条件下,未转染的HEK293细胞,只存在微弱的背景电流,不存在hERG2电流,详见图1A。用hERG2转染HEK293细胞48~72 h,可记录出典型的hERG2电流,时间依赖性电流和尾电流在+20 mV去极化刺激下达到最大值。之后加入西沙比利存储液,使终浓度为1 μmol/L,5 min后再次记录同一细胞,详见图1B。为排除细胞大小对实验的影响,分别以各电压下Step电流和尾电流的密度pA/pF对测试电压作IStep-V曲线和ITail-V曲线,发现当测试电压高于-20 mV后,西沙比利使单位面积上电流幅度下降差异有统计学意义,详见图1C、D。
图1 西沙比利对HEK293上表达的hERG2电流的影响Fig.1 Effect of cisapride on human ERG2 channels expressed on HEK293 cells
观察西沙比利由低到高浓度对hERG2电流的影响,将实验分为 6 组:对照组,0.001、0.01、0.10、1.0、10.0 μmol/L西沙比利组,给予钳制电压-80 mV,时长1 s;去极化至+20 mV,时长3 s;后复极化至-40 mV,时长3 s,记录用药前和用药后2 min hERG2电流,详见图2A。a至 f分别为未加药、加入0.001、0.01、0.10、1.0、10.0 μmol/L 西沙比利作用前和作用后2 min的hERG2电流,图中比例尺纵轴代表电流幅度500 pA,横轴代表时长1 s。被抑制电流占总电流的百分比=(I前-I后)/I前电流,即电流抑制率。本研究显示随着西沙比利浓度逐渐上升,平均抑制率也逐渐增加。10.0 μmol/L Cisapride作用2 min可完全 抑制hERG2电流,有效率达100%详见图2B。
图2 西沙比利对HEK293上表达的hERG2电流的影响的浓度依赖性Fig.2 Concentration dependence of hERG2 channels blocked by cisapride
观察时间因素对西沙比利抑制hERG2电流的影响,本实验对照组浴池液中不加入西沙比利,记录同一细胞2、4、6和8 min的hERG2电流。实验组为浴池液中加入西沙比利,终浓度为1 μmol/L,记录同一细胞加药前和加药后2、4、6和8 min的hERG2电流,详见图3A。说明西沙比利抑制hERG2电流的作用具有时间依赖性。分别以各电压下尾电流峰值对测试电压作ITail-V曲线,发现当电压高于-20 mV后,随时间增加,残存尾电流逐渐减小,西沙比利抑制作用加强,8 min时hERG2电流被完全抑制,详见图3B。
图3 西沙比利对HEK293上表达的hERG2电流的抑制的时间依赖性Fig.3 Time dependence of hERG2 channels blocked by cisapride expressed on HEK293 cells
HERG通道属于电压依赖性钾通道家族的一部分,但在电流特性方面相对较复杂,与传统钾通道特性不同。当膜电位去极化时被激活,几乎同时又发生失活,在较高的去极化电压下失活甚至比激活更快,使得通道电导反而减小,表现为内向整流特性。当膜电位恢复极化状态时,失活通道又可快速复活,复活过程比在较负膜电位下引起的去活发生更快,所以膜电位复极后可引发比时间依赖性电流更大的尾电流。
关于hERG通道的电流特性,常用经典的双门控结构模型理论来解释:hERG通道结构包括两个独立的通道门:一个胞内的激活门和一个胞外的失活门[9]。失活门活动迅速,而激活门活动相对缓慢,二者以不同速率开放和关闭,配合运动,表现出不同的通道电流。当细胞膜处于静息电位时,胞外的失活门开放,胞内的激活门关闭,此时通道无电流。在去极化刺激下,激活门缓慢开放,钾离子外流,出现随电压升高的外向电流,即激活;电压继续升高,失活门开始关闭,激活门仍然开放,电流不升反降,即失活。当撤除去极化电压时,失活门迅速恢复开放状态,而激活门尚未关闭,此时出现一个大的电流,表示失活的移去(再激活,其大小反映了通道实际的开放程度)。随后激活门缓慢关闭,进入缓慢的去活阶段。
目前已报道的hERG通道抑制剂主要有:E-4031[10-11]、多菲特利[12]、维拉帕米[13]等,均在不同程度上影响了该通道的门控特性,使通道的门控特性改变,造成电流幅度下降或完全消失。1997年,Mohammad等[8]根据过量西沙比利引发LQTs综合征和致死性心律失常这一临床现象,证实了西沙比利对于HEK293细胞中异源性表达的hERG1通道具有抑制作用,使hERG1外向输送钾离子的功能减弱。提示西沙比利是一种新型hERG通道阻滞剂。其抑制作用具有明显的浓度依赖性和电压依赖性,即西沙比利浓度越高,抑制作用越强,电压越高,抑制作用越强。
本研究中选取西沙比利浓度0.001~10.0 μmol/L,结果显示低浓度(0.001 μmol/L)西沙比利即对hERG2通道具有抑制作用,高于1 μmol/L西沙比利可完全抑制hERG2电流。同浓度西沙比利作用下,hERG2的残存电流随时间延长而减弱。提示胃肠动力药物西沙比利能抑制HEK293细胞上表达的hERG2电流,包括时间依赖性电流和尾电流,因此西沙比利不能作为特异性抑制剂来区分 hERG1与hERG2通道;这种抑制作用呈现浓度依赖性和时间依赖性。但抑制作用的具体机制以及西沙比利对hERG通道的激活、失活等门控动力学特性的影响尚待进一步研究。
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