shRNA干扰肾癌786-O细胞株中HIF-2α的表达对VEGF的影响

巩进伟 段建敏 卢建中 李烨 杨宁强 赵永录 王培龙

我们应用免疫组化方法检测肾癌标本中HIF-2α和VEGF蛋白的表达，构建HIF-2αshRNA真核表达载体质粒，测序鉴定，转染细胞。探讨低氧环境下HIF-2α和VEGF的表达及相关性。

材料与方法

共收集肾癌患者肾组织标本76例，其中男41例，女35例，年龄30～77岁，平均54岁。Fuhrman分级：Ⅰ级22例，Ⅱ级35例，Ⅲ～Ⅳ级19例。TNM分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期27例。以12例癌旁组织作为正常对照组。

免疫组化采用PV9001二步法，PBS代替一抗做阴性对照。镜下胞质及胞核内有棕黄色染色颗粒即为阳性。根据Genbank提供的HIF-2αmRNA序列，应用Ambion公司的在线设计siRNA工具，设计合成发卡样两端反向互补配对的寡核苷酸5′-CGACCTGAAGATTGAAGTG-3′序列，同时合成互补链（反义链），其中正义链5′端引入BamHⅠ酶切位点，反义链5′端引入EcoRⅠ酶切位点，该重组质粒由广州复能公司合成。合成质粒后转化DH5α感受态细胞中，37℃轻摇培养1h，取菌液接种于含50μg／ml氨苄青霉素LB培养平板37℃培养过夜，挑取阳性单克隆进行扩增，取200μl菌液送公司测序，余按试剂盒说明书进行DNA小量抽提。

肾透明细胞癌786-O细胞株常规培养于含10%的胎牛血清，青、链霉素100U／ml RPMI 1640培养液中，实验设对照组和实验组，两组均设置常氧和低氧组，共4组。对照组转染空质粒，实验组转染psiHIV-U6。常氧组在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养。低氧组在含150μmol／L CoCl2和10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养。培养786-O细胞48h后提取总RNA，5×primeScriptRT Master Mix 2μl，加 总 RNA 后 补 无 RNA 酶 水 至 10μl，37 ℃、15min；85℃5s反转录成cDNA。20μl Real time-PCR反应体系SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ2×10μl，引物各0.8μl（上游引物：5′CATGCGCTAGACTCCGAGAACA3′，下游引物：3′GCTTTGCGAGCATCCGGTA5′），用 GAPDH 作为内参照进行半定量（GAPDH 序列1：5′GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3′；2：5′TGGTGAAGACGCCAGTGGA3′）cDNA溶液2μl，补双蒸水至20μl。两步法PCR扩增标准程序，Stage 1：95℃、30s预变性；Stage 2：95℃、5s，60℃30s，重复40个循环后解离。脂质体转染细胞72h后收集细胞，应用免疫印迹法检测VEGF蛋白水平变化。

结 果

HIF-2α主要表达于癌细胞的胞核，VEGF的表达染色部位在癌细胞胞质中。癌旁正常的肾组织中HIF-2α表达仅1例。HIF-2α阳性表达率为80.0%（61／76）。HIF-2α蛋白表达与肾癌患者性别（P＝0.116）、年龄（P＝0.052）无相关性；与病理类型（P＝0.046）、病理分级（P＝0.005）、临床分期（P＝0.031）有显著相关性。VEGF蛋白表达与肾癌患者性别（P＝0.581）、年龄（P＝0.09）、病理类型（P＝0.596）无相关性；但与病理分级（P＝0.023）、临床分期（P＝0.031）有显著相关性。HIF-2α和VEGF的表达呈正相关（r＝0.315，P＝0.006），肾癌组织中两者有同时升高趋势。

构建重组质粒psiHIV-U6成功后，转化、摇菌扩增后，测序。采用Real time-PCR方法检测转染细胞48h后HIF-2α mRNA表达情况，可探讨是否抑制HIF-2αmRNA表达后，VEGF蛋白的表达量变化情况，免疫印迹法更为准确检测到转染重组质粒到786-O细胞72h后VEGF蛋白的表达量。对照组中低氧环境HIF-2αmRNA的表达量较常氧环境增高约17.6%，差异有统计学意义（P＝0.04）；实验组中常氧组与对照组中常氧组相比，抑制率达61.5%，差异有统计学意义（P＝0.021）（图1）。对照组中低氧组与常氧组比较，VEGF蛋白表达增加了28.3%（P＝0.037）。实验组转染重组质粒psiHIV-U6后，实验组中常氧组VEGF蛋白水平下降了54.5%（P＝0.001），低氧组下降了27.6%（P＝0.026）（表1，图2）。

图1 质粒转染细胞后HIF-2αmRNA的表达情况

表1 免疫印迹法分析RNA干扰对786-O细胞中VEGF蛋白的表达抑制（±s，n＝3）

表1 免疫印迹法分析RNA干扰对786-O细胞中VEGF蛋白的表达抑制（±s，n＝3）

组别VEGF对照常氧组0.743 0±0.056 7对照低氧组 0.954 7±0.105 7实验常氧组 0.337 8±0.060 0实验低氧组0.537 7±0.086 4

质粒转染细胞后免疫印迹法测定VEGF蛋白的表达情况

讨 论

肿瘤细胞的快速增殖和高代谢状态导致肿瘤氧供不足，肿瘤缺氧是肿瘤组织中常见的现象。HIF-2是肿瘤耐受低氧环境的标志物，主要由HIF-2α和HIF-1β两个亚单位构成。α和β亚基构成了具有转录活性的异源二聚体。目前已明确HIF-2α基因参与到肿瘤的发生、发展机制中。低氧或者营养不足时发生的反应性代谢变化使细胞能适应和存活，但低氧和营养不足进一步加重时，肿瘤则通过以增加新生血管或者以自身为食物等策略来求生，这种自我异常调节对肿瘤的发生和进展具有重要的意义。肿瘤组织中HIF-2α失活可导致肿瘤血管生成障碍。相关体内实验研究表明，将超表达HIF-2α的细胞株皮下注射到同基因小鼠体内，与对照组相比较，肿瘤结节形成并结构良好，有高度的血管网形成［1］。低氧基因的表达和基因调节的细胞外刺激有各种的细胞内信号通路调节，Ras-RCF-MEK-ERK信号通路最为多见［2］。肿瘤细胞与正常细胞相比基因组更易发生突变。这与HIFs干扰DNA错误配对修复系统修复DNA损伤能力有关。本实验研究重组质粒转染786-O细胞，构建的HIF-2α表达质粒对786-O转染效率可达42%。特异性干扰HIF-2α的表达，观察HIF-2αmRNA明显受到抑制。在低氧的状态下，通过PHD的抑制作用，HIF-2α不能被羟基化，从而增加了蛋白的稳定性和活性，故对照组低氧环境HIF-2αmRNA表达量增高。常氧下，利用α-酮戊二酸和铁作为辅因子，PHD羟基化HIF-2α中两个保守的脯氨酸残基（pro405，pro531），导致HIF-2α聚泛素化继而被26s蛋白酶体降解，故在常氧的环境下HIF-2αmRNA表达量降低。我们前期实验研究发现HIF-2α和VEGF在正常膀胱组织中不表达，而在膀胱癌组织中表达较强，且两者的表达与肿瘤的病理分级和临床分期密切相关。HIF-2α表达与VEGF表达也呈正相关［3］。相关研究表明，HIF-2α高表达患者与临床分期及不良预后密切相关，与肿瘤低分化级别也有关系［4］。本研究结果也支持上述观点，HIF-2和VEGF与肾癌患者临床分期及病理分级相关，两者之间呈正相关，随着癌组织分化程度的降低，其HIF-2α蛋白的表达量相应增加。

［1］ FavierJ，Lapointe S，Maliba R，et al.HIF2alpha reduces growth rate but promotes angiogenesis in a mouse model of neuroblastoma［J］.BMC Cancer，2007，7：139.

［2］ Chang L，Karin M.Mammalian MAP kinase signalling cascades［J］.Nature，2001，410（6824）：37-40.

［3］ 陈小勇，段建敏，卢建中，等.低氧诱导因子2和血管内皮生长因子在膀胱癌中的表达及意义［J］.中华泌尿外科杂志，2004，25（12）：844-847.

［4］ Patel SA，Simon MC.Biology of hypoxia-inducible factor-2alpha in development and disease［J］.Cell Death Differ，2008，15（4）：628-634.