大孔吸附树脂分离纯化小蓟多糖的工艺研究

聂倩+张直峰+吕建平+闫桂琴

摘要：试验以吸附率与解析率为考察指标，比较4种大孔吸附树脂D101、D4020、AB-8、X-5对小蓟（Cirsium setosum）多糖的纯化效果。采用分光光度法测定小蓟多糖的含量，用静态与动态吸附-解析方法从4种树脂中筛选出最适树脂，采用单因素试验和正交试验优化其纯化工艺。结果表明，AB-8型大孔树脂为纯化小蓟多糖的最佳树脂；其纯化最佳工艺条件为：上样液浓度2.0 mg/mL，上样量30 mL，流速1.0 mL/min，洗脱剂pH 7.0。在此工艺条件下，AB-8对小蓟多糖的解析率可达77.93%。

关键词：小蓟（Cirsium setosum）；多糖；大孔吸附树脂；吸附；解析；纯化

中图分类号：Q946.3；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）19-4661-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.041

Isolation and Purification of Polysaccharide from Cirsium setosum

by Macroporous Resin

NIE Qian， ZHANG Zhi-feng， LV Jan-ping， YAN Gui-qin

（School of Life Science，Shanxi Normal University，Linfen 041004，Shanxi，China）

Abstract： Using adsorption rate and desorption rate as indexes， the purification effects of four macroporous adsorption resin including D101， D4020， AB-8 and X-5 were compared. Spectrometry method were used to determine the content of polysaccharides isolated from Cirsium setosum by static and dynamic adsorption-analytical method with four resins. After screening the optimal resin， the purification process were optimized with orthogonal test and single factors test. The results showed that AB-8 was the optimum macroporous resin for absorbing polysaccharide from Cirsium setosum. The optimum technology conditions were sample concentration of 2 mg/mL， sample volume of 30 mL， flow velocity of 1.0 mL/min and pH value of eluent of 7.0. The desorption rate of polysaccharides from Cirsium setosum reached 77.93% under the optimal conditions.

Key words：Cirsium setosum； macroporous adsorption resin； polysaccharide； adsorption； desorption；purification

小蓟（Cirsium setosum）为菊科植物，具有凉血止血，祛淤消肿的功能，可用于治疗衄血、吐血、尿血、便血、崩漏下血、外伤出血、痈肿疮毒等，是传统的中药材，在《本草纲目》、《本草经集注》、《医学衷中参西录》等中均有记载，其中药化学成分有原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、蒙花甙、豆甾醇等。小蓟在中国分布广泛，中欧、东欧、俄罗斯东部、日本、朝鲜等地区亦有分布，资源极其丰富。小蓟同时也可以食用，含有丰富的营养物质，是人们喜爱的民间野菜。多糖是存在于植物体内的一种天然活性物质，因具抗氧化、抗癌、抗病毒、降血糖、抑菌等[1-5]多种活性而被普遍应用于保健食品、生物医药、环保、化妆品等领域[6]。大孔吸附树脂具有理化稳定性高、吸附选择性强、富集效果好、提取工艺简便、解析条件温和、再生简单、使用周期长、分离效率高、分离得到的有效成分纯度高等优点，近年来被广泛用于天然植物中活性成分的提取、分离和纯化[7]。大孔吸附树脂对于多糖提取是比较理想的吸附剂[8-10]。但是目前国内鲜见采用大孔吸附树脂分离、纯化小蓟多糖的研究报道。基于此，本研究对纯化小蓟多糖大孔树脂进行了筛选并对其纯化工艺参数进行了优化，以期为小蓟资源的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 试验用小蓟：采自临汾市古县，洗净于55 ℃烘干，粉碎后过60～80目筛备用。试剂：石油醚、三氯甲烷、正丁醇、无水乙醇、95%乙醇、丙酮、乙醚（均为分析纯）、葡萄糖、蒽酮、浓硫酸。大孔吸附树脂：分别为AB-8、D4020、X-5、D101，购于天津市光复精细化工研究所（均为一级品）。

1.1.2 仪器 D101型电热恒温鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器厂），高速万能粉碎机（天津市斯泰仪器有限公司），BS-110S型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]，KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），H-1850R型离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司），HHS-6型电热恒温水浴锅（海宁市新华医疗器械厂），RE-2000A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），754型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 粗多糖的制备 称取小蓟粉末60 g，按料液比（g/mL，下同）1∶10加入600 mL蒸馏水，于60 ℃超声提取30 min，提取液经过滤收集，滤渣加入450 mL蒸馏水按上述步骤再次提取1次，合并滤液并浓缩至100 mL，依次经石油醚脱脂，氯仿-正丁醇（体积比为5∶1）脱蛋白4次[11]后加入3倍体积的95%乙醇，于4 ℃醇沉过夜，离心，沉淀依次用适量无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，将沉淀真空干燥至恒重，得粗多糖备用。

1.2.2 小蓟多糖含量的测定 采用蒽酮—浓硫酸法[12]对小蓟多糖含量进行测定。以葡萄糖溶液为标准品在625 nm处测定吸光度，以葡萄糖溶液的浓度（x，mg/mL）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：y=2.85x+0.002 8，R2=0.997 3。

精密称取干燥后粗多糖20 mg，溶于20 mL蒸馏水中，得1 mg/mL的样液。按上述方法测定其吸光度，根据回归方程计算其多糖含量。

1.2.3 大孔吸附树脂的预处理 将大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡24 h，充分膨胀后，用乙醇洗至洗脱液加3倍量蒸馏水无白色混浊现象，再用蒸馏水洗至无醇味，浸泡于蒸馏水中备用。

1.2.4 大孔树脂的筛选

1）静态吸附[13]与静态解析试验。精密称取经预处理的4种大孔吸附树脂各3份，每份2 g，置于250 mL锥形瓶中，并分别加入150 mL一定浓度的多糖样品溶液，置于摇床，室温下振荡吸附360 min，每隔30 min取一次样，测定其多糖含量，根据公式（1）、（2）计算大孔树脂的吸附量及吸附率。

Q=（C0-Ce）×V1/m （1）

E=（C0-Ce）/C0×100%（2）

公式（1）、（2）中，Q为吸附量（mg/g）；C0为吸附前样品溶液多糖含量（mg/mL）；Ce为吸附后溶液多糖含量（mg/mL）；V1为提取液体积（mL）；m为树脂干重（g）；E为吸附率。

将静态吸附试验过滤后的大孔吸附树脂置于250 mL的锥形瓶中，加入150 mL蒸馏水作为洗脱剂，置于摇床振荡解吸240 min，每隔30 min取一次样，测定其多糖含量，根据公式（3）、（4）计算大孔树脂的解析量及解析率。

D=C′×V2/m（3）

E′=C′×V2/（C0-Ce）×V1×100%（4）

公式（3）、（4）中，D为解析量（mg/g）；C′为洗脱液中样品溶液多糖的含量（mg/mL）；V2为洗脱液体积（mL）；E′为解析率。

2）动态吸附与动态解析试验。准确称取一定量经过预处理的4种大孔树脂，湿法装柱（1.2 cm×30 cm，层析柱径高比为1∶25，体积为33.912 cm3），吸取一定浓度（与静态吸附试验中的多糖样品溶液浓度相同）的多糖样液30 mL，控制流速为1.0 mL/min，待吸附完成后，测定其多糖含量，按照公式（1）、（2）计算树脂的吸附量及吸附率。以pH 7.0的蒸馏水作为洗脱剂，采用与吸附试验相同的流速进行洗脱，待解析完成后，测定其多糖含量，按照公式（3）、（4）计算树脂的解析量及解析率。

1.2.5 大孔树脂动态吸附单因素的确定 按“1.2.4”中动态吸附试验的方法湿法装柱。再分别考察上样液浓度（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL）、上样量（10、20、30、40、50、60 mL）、流速（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min）和洗脱剂pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）对大孔树脂动态吸附与解析效果的影响。

1.2.6 正交试验优化大孔树脂纯化小蓟多糖工艺 根据单因素试验结果，以小蓟多糖解析率为考察指标，分别选取上样液浓度、上样量、流速和洗脱剂pH 4个因素，进行L9（34）正交试验，确定大孔树脂纯化小蓟多糖的最佳工艺。正交试验因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的筛选

2.1.1 静态吸附与静态解析试验结果 由于物化性质的不同，各种型号树脂对多糖的吸附及解析能力是不同的。由图1可知，4种大孔树脂对小蓟多糖的吸附量均随吸附时间的增加呈相似的上升趋势，且均在270 min时趋于饱和，至360 min时均达饱和平衡状态。4种大孔树脂对小蓟多糖的最终吸附量排序为：X-5>AB-8>D101>D4020。

在筛选最佳树脂的过程中，需要综合考虑树脂的吸附能力，不仅需要吸附能力强，还需要有较强的解析能力才能保证有效成分被最大限度回收[14]。由图2可知，大孔树脂静态解析曲线趋势与静态吸附曲线的趋势类似，其对小蓟多糖的解析量均在210 min时趋于饱和，240 min时达平衡饱和状态。综合分析后认为AB-8树脂的解析能力整体较高。4种大孔树脂对小蓟多糖的最终解析量排序为：AB-8>X-5>D101>D4020。

综合静态吸附与静态解析试验结果如表2。由表2可见，虽然X-5树脂的吸附率最高，但其解析率最低，仅为60.92%；D4020树脂的解析率是最高的，但其吸附率却是最低的，仅为42.78%。综合考虑剩余的D101和AB-8树脂，认为AB-8树脂对小蓟多糖的静态吸附及解析能力均较强。

2.1.2 动态吸附与动态解析试验结果 动态吸附及动态解析试验结果（表3）表明，4种树脂对小蓟多糖均有较好的动态吸附及解析性能。综合分析其动态吸附及解析结果，得出其动态吸附及解析能力排序为：AB-8>D101>D4020>X-5。

比较静态吸附与动态吸附的结果，综合分析后认为AB-8树脂是分离纯化小蓟多糖的最佳树脂，且其动态吸附效果优于静态吸附效果。

2.2 大孔树脂动态吸附单因素的确定

2.2.1 上样液浓度对大孔树脂动态吸附与解析能力的影响 将小蓟多糖的初始浓度分别配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL，上样量为30 mL，以1.0 mL/min的流速过柱吸附，待充分吸附后，用pH为7.0的洗脱剂进行解析，其结果见图3。由图3可见，小蓟多糖解析率在上样液浓度为2.0 mg/mL时达到最高峰，之后其解析率随上样液浓度的增加而降低。这是因为上样液浓度低时，树脂未被饱和；上样液浓度过大时，小蓟多糖向树脂内部扩散的速度减慢，堵塞树脂孔隙从而影响其吸附和解析[15]。因此，上样液浓度以2.0 mg/mL为宜，此时，小蓟多糖解析率为77.69%。

2.2.2 上样量对大孔树脂动态吸附与解析能力的影响 分别加入10、20、30、40、50、60 mL样液过柱，其他条件同“2.2.1”，进行动态吸附与解析，其结果见图4。由图4可见，上样量为30 mL时，小蓟多糖解析率最高，为72.08%；之后随上样量的增加小蓟多糖解析率逐渐减少。因此，上样量以30 mL为宜。

2.2.3 流速对大孔树脂动态吸附与解析能力的影响设定大孔树脂动态吸附与解析的流速分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min，其他条件同“2.2.1”，进行动态吸附与解析，其结果见图5。由图5可见，流速在0.5～1.5 mL/min时，小蓟多糖的解析率随流速的提高而略有降低。但当流速高于1.5 mL/min时，小蓟多糖的解析率下降较多。虽然流速在0.5 mL/min时小蓟多糖的解析率最高，但流速太低，多糖流出速度慢，耗时长；而流速过快时，树脂的交换量降低，从而降低了纯化效率，不能完全发挥出树脂的吸附能力。因此综合分析后认为以1.5 mL/min的流速进行动态吸附与解析为宜。

2.2.4 洗脱剂pH对大孔树脂动态吸附与解析能力的影响 将洗脱剂pH分别调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，其他条件同“2.2.1”，进行动态吸附与解析，其结果见图6。由图6可见，洗脱剂的pH对大孔树脂的解析性能有一定的影响。洗脱剂pH从5.0上升到7.0时，小蓟多糖的解析率呈增加趋势，且在pH7.0时达到最高，为70.72%；但洗脱剂pH从7.0上升到10.0时，小蓟多糖的解析率呈下降趋势。因此，洗脱剂pH选择7.0为宜。

2.3 正交试验结果

由表4可见，各因素对小蓟多糖解析率的影响排序为A>B>D>C，即上样液浓度对小蓟多糖解析率的影响最为明显，其次为上样量，洗脱剂pH和流速的影响较小。其最佳工艺组合为A2B2C1D1，即上样液浓度为2.0 mg/mL，上样量为30 mL，流速为1.0 mL/min，洗脱剂pH为7.0。

以正交试验所得最佳工艺条件进行3次动态吸附验证试验，结果小蓟多糖的解析率分别为77.97%、78.13%、77.69%，平均为77.93%。表明该纯化方法稳定可靠且重现性好。

3 小结与讨论

小蓟作为2005年《中国药典》版收载的常用中药，具有许多医用功效。但对于小蓟的研究多集中于对其化学成分的研究，对其有效成分纯化的研究较少。杨星昊等[16]进行了大孔树脂纯化小蓟总黄酮的研究，表明AB-8和HP-20较适合于分离纯化小蓟总黄酮。但对小蓟多糖成分的提取纯化的优化鲜见报道。张海晖等[17]对板栗壳中原花青素大孔吸附树脂分离纯化工艺优化试验结果表明AB-8树脂的效果最佳；付克等[18]运用大孔树脂对柴芩清肝方提取物进行纯化，结果表明AB-8为最佳树脂；季志红等[19]运用大孔树脂对毛头牛蒡子多糖进行了分离纯化的工艺研究，结果表明AB-8的纯化效果最佳；宋歌等[20]优选大孔吸附树脂分离纯化蜘蛛香中环烯醚萜类成分，结果表明AB-8有良好的吸附性能；孙明礼[21]对半枝莲多糖的脱色剂进行筛选并对其优化，结果表明AB-8有较优效果，解析率高达83.22%；仰榴青等[22]对大孔吸附树脂纯化银杏外种皮多糖进行了研究，认为AB-8吸附性能最好。以上研究结果均显示出AB-8有较优的吸附和解析效果，这与本试验所得结果一致。

影响大孔吸附树脂分离纯化的因素较多，为了达到较好的分离纯化效果，本试验对大孔树脂的型号进行了筛选，对大孔树脂的吸附和解析的影响因素进行了考察。在4种不同型号的大孔吸附树脂中AB-8具有较强的吸附和解析能力，为纯化小蓟多糖的最佳树脂。正交试验结果表明4因素对小蓟多糖解析率影响的排序为A>B>D>C；其纯化最佳工艺条件为：上样液浓度2.0 mg/mL，上样量30 mL，流速1.0 mL/min，洗脱剂pH 7.0。在此条件下，AB-8对小蓟多糖的解析率可达77.93%。通过该工艺，可以有效去除多糖中脂溶性杂质等，选择性地保留有效成分，提高了小蓟多糖的纯度。且正交试验验证结果表明，该工艺稳定可靠、科学合理且重现性好。为小蓟多糖的工业化生产提供了一定的理论基础。

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