酶法提取山豆根总黄酮的工艺研究

赖红芳+邓晰朝+欧阳淼

摘要：为了研究酶法提取山豆根（Sophora tonkinensis Gapnep）总黄酮的最佳工艺条件，对3种酶（纤维素酶、果胶酶、纤维素酶与果胶酶的复合酶）提取山豆根总黄酮的效果进行了比较，选用纤维素酶为提取剂，以山豆根总黄酮得率为考察指标，分别对4个提取参数（提取液pH、提取时间、提取温度及酶加量）进行单因素试验，然后采用正交试验对提取条件进行优化。结果表明，山豆根总黄酮的最佳提取条件为：酶加量0.5%、提取温度70 ℃、提取时间1.5 h、提取液pH 4.0，在此条件下，山豆根总黄酮的提取率可达到0.73%。该结果可为开发利用山豆根植物资源提供理论依据。

关键词：山豆根（Sophora tonkinensis Gapnep）；纤维素酶；总黄酮

中图分类号：R284.2；Q946.8 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）19-4657-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.040

The Technology of Extracting flavonoids from Sophora tonkinensis Gapnep

with Enzymatic Method

LAI Hong-fang，DENG Xi-chao，OU-YANG Miao

（Department of Chemistry and Life Sciences， Hechi University，Yizhou 546300，Guangxi，China）

Abstract： To study the optimal technology of extracting total flavonoids from Sophora tonkinensis gapnep， three kinds of enzymes including cellulose enzyme， pectinase and the compound of two enzymes were used to compare the extraction effect with single factor test and orthogonal design. The extraction parameters included pH，enzymatic time， enzymatic temperature and enzyme amount. The results showed that the yield of total flavone extracted from Sophora tonkinensis gapnep were 0.73% under the optimal conditions of enzymolysis 1.5 hours under 70 ℃ and pH of 4.0 with the enzyme amount of 0.5%. It will provide a reference for developing Sophora tonkinensis Gapnep.

Key words： Sophora tonkinensis Gapnep； cellulose enzyme； total flavonoids

山豆根（Sophora tonkinensis Gapnep）又名广豆根、柔枝槐、苦豆根等，为豆科蔓生矮小灌木植物越南槐的根，主产于广西西南部至西北部[1]。山豆根的药用功效始载于唐代《开宝本草》，其药性苦寒、有毒、归肺、胃经，具有清热解毒、利咽消肿的功效，近代临床常用于治疗咽喉肿痛、牙龈肿痛、湿热黄疽、湿热带下、心律失常等症[2]。山豆根中含有丰富的生物碱、黄酮类成分[1，3，4]，主要为黄酮、二氢黄酮异黄酮、查耳酮和紫檀素类化合物，以二氢黄酮类化合物最为丰富。黄酮类化合物具有多种生物活性，能起到抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化自由基、抗炎、镇痛、保肝等功效[5]。

目前提取黄酮的方法主要有有机溶剂、水或热水提取、酶解、二氧化碳超临界提取、大孔树脂吸附提取等[6]，其中有机溶剂、水或热水提取法存在排污量大、有效成分损失多、提取效率低等缺点；二氧化碳超临界提取法一次性投资大、成本高；大孔树脂吸附法使有机溶剂难以回收，损耗大、成本高、易燃易爆、对环境污染严重[7]；酶解法的污染小、作用条件温和、高效安全，提取率比其他方法提高了2%～3%[8]。因此，本试验采用酶法提取山豆根中总黄酮，通过比较几种酶的提取效果，筛选出高效率的酶；同时，采用单因素试验分析提取温度、提取液pH、酶加量、提取时间4个主要因素对山豆根总黄酮提取率的影响，并在单因素试验的基础上通过正交试验法优化了山豆根总黄酮提取工艺条件，对试验结果进行验证，探究出从山豆根中提取黄酮类化合物的最佳工艺流程，以期为山豆根的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验用山豆根购于广西宜州市中药市场，经河池学院邓晰朝副教授鉴定为豆科蔓生矮小灌木植物越南槐的根。

芦丁（Rutin）标准品（UV≥98%，批号20110825）；纤维素酶（活性≥1 400 U/mg）、果胶酶（活性≥1 000 U/mg），上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、磷酸氢二钠、柠檬酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、镁粉、三氯化铝、浓盐酸均为分析纯。

1.2 仪器

UV-2102PCS型紫外分光光度计[尤尼科（上海）仪器有限公司）]；pHS-3B型pH计（上海精密科学仪器有限公司）；SHB—Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸易有限公司）；SSY4型电热恒温水浴锅（北京泰克仪器有限公司）；DGF30/14-22A型电热鼓风干燥箱（南京实验仪器厂）；FZ102型微型植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；AE240S型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 山豆根总黄酮提取工艺流程 山豆根干燥，粉碎（过30目筛）→称重→溶解→调节pH→添加酶→恒温水浴→高温灭酶→过滤→定容→显色，测吸光度。

1.3.2 样品溶液的制备 准确称取20.00 g山豆根粉末于500 mL的圆底烧瓶中，按料液比（g/mL，下同）1∶15加入蒸馏水溶解，调节pH，放置一定温度水浴5 min后，加入酶并恒温水浴，提取一定时间后，100 ℃高温灭酶，冷却，抽滤，滤液置于500 mL的容量瓶，用80%乙醇溶液定容至刻度，摇匀备用。

1.3.3 酶的筛选试验 准确称取4份20.00 g山豆根粉末于500 mL的圆底烧瓶中，按照“1.3.2”的步骤，考察在料液比1∶15、提取液pH 5.0、提取温度50 ℃、提取时间1.5 h的条件下，分别加入1.5%纤维素酶、果胶酶、纤维素酶与果胶酶的复合酶（配合比为1∶1）（同时设置传统醇提法为空白对照）对山豆根总黄酮得率的影响[9]，以筛选出最适酶解的酶用于下一步试验。

1.3.4 酶解最佳条件的确定[10] 考察不同的酶加量（酶加量=酶用量/山豆根的质量×100%）（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、提取液pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）、提取温度（30、40、50、60、70 ℃）、提取时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）对山豆根总黄酮提取效果的影响。在单因素试验的基础上进行正交试验来确定酶法提取山豆根总黄酮的最佳工艺条件。正交试验因素与水平见表1。

1.3.5 山豆根总黄酮含量测定

1）芦丁标准品溶液的制备。精确称取20.0 mg的芦丁标准品，用80%的乙醇溶液微热溶解，待完全溶解后，用80%的乙醇溶液定容于200 mL的容量瓶中，摇匀，制备成0.1 mg/mL芦丁标准品溶液。

2）标准曲线的绘制。精确量取芦丁标准品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分别加入25 mL比色管中， 加入5%的亚硝酸钠溶液0.25 mL，摇匀，放置6 min，然后加入10%的硝酸铝溶液0.25 mL，摇匀， 放置6 min，再加入4%的氢氧化钠溶液2.5 mL， 用80%的乙醇溶液定容至10 mL，摇匀，室温放置15 min后，以试剂空白做参比，在510 nm处测定其吸光度，以芦丁标准品溶液浓度C（mg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，制作标准曲线，得回归方程为：A=14.714C+0.001 9，r=0.999 8，表明芦丁标准品溶液浓度和吸光度呈良好的线性关系。

3）样品中总黄酮含量的测定方法。取“1.3.2”中的样品提取液2 mL于3个平行的25 mL比色管中，按上述操作测其吸光度，按照回归方程计算出样品中总黄酮的含量，并计算总黄酮得率。

山豆根总黄酮得率=[C×V×D]/（m×1 000）×100%

上式中，C为样品中总黄酮的含量（mg/mL），V为样品溶液体积（mL），D为稀释倍数，m为样品山豆根的质量（g）。

1.3.6 验证试验 准确称取5份20.00 g山豆根，按料液比1∶15加入蒸馏水溶解，用正交试验得出的最佳提取工艺条件进行提取，按“1.3.5”的操作方法测定其吸光率，计算其总黄酮含量，并计算总黄酮得率。

1.3.7 加标回收试验 准确称取20.00 g已知总黄酮含量的山豆根5份，分别加入5 mL 0.1 mg/mL的芦丁标准品溶液，按最佳提取工艺条件进行提取，得样品提取液后，按“1.3.5”的操作方法分别测其吸光度，根据回归方程，分别计算山豆根样品加标样后其总黄酮含量，按以下公式计算回收率和相对标准偏差。回收率=（加标样后测得的样品中总黄酮质量-加标样前样品中总黄酮质量）/芦丁标准品的加入量×100%。

2 结果与分析

2.1 酶的筛选结果

由表2可见，与传统醇提法（空白对照）相比较，添加不同的酶后山豆根总黄酮的得率均有所增加，其中以添加纤维素酶时山豆根总黄酮的得率最高，主要是由于纤维素酶破坏了细胞壁，使细胞内的黄酮得以释放。因此，选择纤维素酶作为山豆根总黄酮提取的适用酶。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 酶加量对山豆根总黄酮得率的影响 在提取液pH 5.0、提取温度50 ℃、提取时间1.5 h的条件下，考察不同的酶加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）对山豆根总黄酮得率的影响，其结果见图1。由图1可知，随着纤维素酶用量的加大，山豆根总黄酮得率变化不大，在纤维素酶加量为1.0%时山豆根总黄酮得率达到最大值，之后再增大酶加量，其得率保持在一定水平并略有下降。分析其原因是酶量过高时，底物浓度不能对酶达到饱和，致使酶的作用受到抑制[11]。因此，酶加量以1.0%为宜。

2.2.2 提取液pH对山豆根总黄酮得率的影响 在酶加量1.0%、提取温度50 ℃、提取时间1.5 h的条件下，考察提取液不同pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）对山豆根总黄酮得率的影响，其结果见图2。由图2可知，在提取液pH为3.0～4.0时山豆根总黄酮得率迅速增加，在pH 5.0时达到最大值，之后随提取液pH的进一步增加，山豆根总黄酮得率开始下降，表明微酸性条件下纤维素酶的活性最大。因此，提取液pH以5.0为宜。

2.2.3 提取温度对山豆根总黄酮得率的影响 在提取液pH 5.0、酶加量1.0%、提取时间1.5 h的条件下，考察不同的提取温度（30、40、50、60、70 ℃）对山豆根总黄酮得率的影响，其结果见图3。由图3可知，随着提取温度的增加，山豆根总黄酮的得率也逐渐增大，在60 ℃时达到最高，之后随提取温度的继续增加，其总黄酮得率呈下降趋势。分析其原因可能是高温下蛋白质容易变性，酶的活性受到了影响。因此，提取温度选择60 ℃为宜。

2.2.4 提取时间对山豆根总黄酮得率的影响 在提取液pH 5.0、酶加量1.0%、提取温度60 ℃的条件下，考察不同的提取时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）对山豆根总黄酮得率的影响，其结果见图4。由图4可知，提取时间为1.5 h时山豆根总黄酮的得率最高，之后随着提取时间的进一步延长，山豆根总黄酮的得率反而下降。分析其原因可能是由于提取时间太长不仅会使酶的活性降低，也引起样品中的黄酮结构发生变化，最终使总黄酮含量降低，所以提取时间以1.5 h为宜。

2.3 正交试验结果

正交试验结果见表3。从表3可知，各因素对总黄酮得率的影响顺序为：C（提取时间）>D（提取液pH）>A（酶加量）>B（提取温度）；山豆根总黄酮提取最佳工艺条件组合为A1B3C2D1，即酶加量0.5%、提取温度70 ℃、提取时间1.5 h、提取液pH 4.0。

2.4 验证试验结果

验证试验结果表明，山豆根总黄酮的得率分别为0.74%、0.72%、0.72%、0.73%、0.74%，平均得率为0.73%，相对标准偏差为1.24%。由此可知，按最佳提取工艺条件所得山豆根总黄酮得率明显高于单因素和正交试验的结果，表明该最佳提取工艺条件可行。

2.5 加标回收试验结果

加标回收试验结果见表4。由表4可知，山豆根总黄酮的平均加标回收率为98.84%，相对标准偏差为1.25%，符合加标回收的要求。因此，分析结果是准确的。

3 小结与讨论

本试验首先对纤维素酶、果胶酶及其复合酶提取山豆根总黄酮的效果进行比较，由试验结果可知纤维素酶处理山豆根的效果最好，对山豆根总黄酮得率的影响最显著。因此，筛选出纤维素酶作为试验用酶，通过单因素试验，考察了酶加量、提取液pH、提取温度和提取时间4个因素对山豆根总黄酮得率的影响，在此基础上设计4因素3水平正交试验，得到山豆根总黄酮最佳提取工艺条件为：酶加量0.5%、提取温度70 ℃、提取时间1.5 h、提取液pH 4.0。在此条件下，山豆根总黄酮得率可达到0.73%，与醇提法相比有明显提高，说明纤维素酶具有反应条件温和、选择性高的特点，酶的专一性又避免了对底物外物质的破坏，减少了中药材中有效成分溶出及溶剂提取时的传质阻力，缩短了提取时间，提高了提取率从而使有效成分容易溶出[12，13]，这些都将有利于山豆根资源的进一步高效利用。

参考文献：

[1] 隆金桥， 林 华， 羊晓东， 等. 广西山豆根化学成分的研究[J]. 云南大学学报（自然科学版）， 2011， 33（1）： 72-76.

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[13] 王岩岩， 李文娟. 纤维素酶提取陈皮黄酮的工艺条件[J]. 食品与生物技术学报， 2008， 27（2）：71-74.

2.2.4 提取时间对山豆根总黄酮得率的影响 在提取液pH 5.0、酶加量1.0%、提取温度60 ℃的条件下，考察不同的提取时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）对山豆根总黄酮得率的影响，其结果见图4。由图4可知，提取时间为1.5 h时山豆根总黄酮的得率最高，之后随着提取时间的进一步延长，山豆根总黄酮的得率反而下降。分析其原因可能是由于提取时间太长不仅会使酶的活性降低，也引起样品中的黄酮结构发生变化，最终使总黄酮含量降低，所以提取时间以1.5 h为宜。

2.3 正交试验结果

正交试验结果见表3。从表3可知，各因素对总黄酮得率的影响顺序为：C（提取时间）>D（提取液pH）>A（酶加量）>B（提取温度）；山豆根总黄酮提取最佳工艺条件组合为A1B3C2D1，即酶加量0.5%、提取温度70 ℃、提取时间1.5 h、提取液pH 4.0。

2.4 验证试验结果

验证试验结果表明，山豆根总黄酮的得率分别为0.74%、0.72%、0.72%、0.73%、0.74%，平均得率为0.73%，相对标准偏差为1.24%。由此可知，按最佳提取工艺条件所得山豆根总黄酮得率明显高于单因素和正交试验的结果，表明该最佳提取工艺条件可行。

2.5 加标回收试验结果

加标回收试验结果见表4。由表4可知，山豆根总黄酮的平均加标回收率为98.84%，相对标准偏差为1.25%，符合加标回收的要求。因此，分析结果是准确的。

3 小结与讨论

本试验首先对纤维素酶、果胶酶及其复合酶提取山豆根总黄酮的效果进行比较，由试验结果可知纤维素酶处理山豆根的效果最好，对山豆根总黄酮得率的影响最显著。因此，筛选出纤维素酶作为试验用酶，通过单因素试验，考察了酶加量、提取液pH、提取温度和提取时间4个因素对山豆根总黄酮得率的影响，在此基础上设计4因素3水平正交试验，得到山豆根总黄酮最佳提取工艺条件为：酶加量0.5%、提取温度70 ℃、提取时间1.5 h、提取液pH 4.0。在此条件下，山豆根总黄酮得率可达到0.73%，与醇提法相比有明显提高，说明纤维素酶具有反应条件温和、选择性高的特点，酶的专一性又避免了对底物外物质的破坏，减少了中药材中有效成分溶出及溶剂提取时的传质阻力，缩短了提取时间，提高了提取率从而使有效成分容易溶出[12，13]，这些都将有利于山豆根资源的进一步高效利用。

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[10] 刘晓光， 毛 波， 胡立新. 酶解法提取山楂黄酮的工艺[J]. 食品研究与开发， 2010， 31（8）：56-59.

[11] 章 斌，侯小桢. 复合酶法提取广佛手总黄酮的工艺[J]. 食品研究与开发， 2010， 31（10）：188-191.

[12] 薛伟明， 张效林， 刘袖洞， 等. 酶—膜法药用植物有效成分提取分离过程应用研究[J]. 西北大学学报（自然科学版）， 1997，27（6）： 494-498.

[13] 王岩岩， 李文娟. 纤维素酶提取陈皮黄酮的工艺条件[J]. 食品与生物技术学报， 2008， 27（2）：71-74.

2.2.4 提取时间对山豆根总黄酮得率的影响 在提取液pH 5.0、酶加量1.0%、提取温度60 ℃的条件下，考察不同的提取时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）对山豆根总黄酮得率的影响，其结果见图4。由图4可知，提取时间为1.5 h时山豆根总黄酮的得率最高，之后随着提取时间的进一步延长，山豆根总黄酮的得率反而下降。分析其原因可能是由于提取时间太长不仅会使酶的活性降低，也引起样品中的黄酮结构发生变化，最终使总黄酮含量降低，所以提取时间以1.5 h为宜。

2.3 正交试验结果

正交试验结果见表3。从表3可知，各因素对总黄酮得率的影响顺序为：C（提取时间）>D（提取液pH）>A（酶加量）>B（提取温度）；山豆根总黄酮提取最佳工艺条件组合为A1B3C2D1，即酶加量0.5%、提取温度70 ℃、提取时间1.5 h、提取液pH 4.0。

2.4 验证试验结果

验证试验结果表明，山豆根总黄酮的得率分别为0.74%、0.72%、0.72%、0.73%、0.74%，平均得率为0.73%，相对标准偏差为1.24%。由此可知，按最佳提取工艺条件所得山豆根总黄酮得率明显高于单因素和正交试验的结果，表明该最佳提取工艺条件可行。

2.5 加标回收试验结果

加标回收试验结果见表4。由表4可知，山豆根总黄酮的平均加标回收率为98.84%，相对标准偏差为1.25%，符合加标回收的要求。因此，分析结果是准确的。

3 小结与讨论

本试验首先对纤维素酶、果胶酶及其复合酶提取山豆根总黄酮的效果进行比较，由试验结果可知纤维素酶处理山豆根的效果最好，对山豆根总黄酮得率的影响最显著。因此，筛选出纤维素酶作为试验用酶，通过单因素试验，考察了酶加量、提取液pH、提取温度和提取时间4个因素对山豆根总黄酮得率的影响，在此基础上设计4因素3水平正交试验，得到山豆根总黄酮最佳提取工艺条件为：酶加量0.5%、提取温度70 ℃、提取时间1.5 h、提取液pH 4.0。在此条件下，山豆根总黄酮得率可达到0.73%，与醇提法相比有明显提高，说明纤维素酶具有反应条件温和、选择性高的特点，酶的专一性又避免了对底物外物质的破坏，减少了中药材中有效成分溶出及溶剂提取时的传质阻力，缩短了提取时间，提高了提取率从而使有效成分容易溶出[12，13]，这些都将有利于山豆根资源的进一步高效利用。

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