Sr18菌代谢产物对松材线虫蛋白质和酶活力的影响

侯金丽+冯欣

摘要：基于Sr18菌（Syncephalastrum racemosum）代谢产物在8 h内具有显著的杀线虫活性，测定了其在8 h内对松树线虫体内总蛋白质含量、SOD、CAT、TChE和ATP酶活性的影响。结果表明，4 h时处理组总蛋白质的含量陡增至0.544 2 mg/mL，显著高于对照组0.429 1 mg/mL，Sr18菌代谢产物干扰了线虫体内蛋白质的代谢；在8 h内，处理组的SOD、CAT、TChE和ATP酶这4种酶活性均低于对照组，Sr18菌代谢产物对线虫体内这4种酶都有不同程度的影响。这一结果为利用Sr18菌代谢产物研究和开发微生物源杀线剂奠定了理论基础。

关键词：Sr18菌（Syncephalastrum racemosum）代谢产物；线虫；蛋白质含量；酶活

中图分类号：S433.89 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）19-4604-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.025

Effects of Sr18 Fungi Metabolites on the Protein Content and the Enzyme

Activities in the Nematode

HOU Jin-li1，FENG Xin2

（1.Henan Industry and Trade Vocational College， Department of Food Engineering ， Zhengzhou 451191， China；

2.Tianjin Key Laboratory of Animals and Plants Resistance， Tianjin Normal University， College of life science， Tianjin 300387， China）

Abstract： Based on Sr18 fungi metabolites with significant nematicidal activity in 8 h， the effects of this extract were evaluated on the content of total protein， the enzyme activities of SOD， CAT， TChE and ATP in 8 h. The results showed that in 4h， the content of total protein in the treatment group increased sharply to 0.544 2 mg/ml， significantly higher than that of the control group（0.429 1 mg/ml）， indicating that Sr18 fungi metabolites were interfered with the nematode protein metabolism. In 8 h， the enzyme activities of SOD， CAT， TChE and ATP of the treatment group were lower than that of the control group， indicating that Sr18 fungi metabolites had different effects on these four kinds of enzyme in the nematode. It will provide a theoretical basis for developing nematicides with microbial resources.

Key words： Sr18（Syncephalastrum racemosum） fungi metabolites； nematode； protein content； enzyme activities.

植物寄生线虫是一类世界性分布的重要植物病原体，其寄生范围广，不仅对林木的危害十分严重，对全世界农作物的生产也构成了严重威胁。据统计，全世界植物寄生线虫不仅造成年经济损失超过1 000亿美元，还给人类和动物带来严重的疾病[1-4]。目前应用最广泛的化学药剂产生了环境污染和增强了线虫抗药性等诸多问题，化学杀线剂的应用受到一定的限制。随着人类环保意识的提高，生物防治成为线虫防治的主导[5]。丝状真菌Sr18（Syncephalastrum racemosum）是本课题组从土壤中筛选出的一株生防菌，其代谢产物在8 h内具有极强的杀线虫活性[6]。为进一步明确Sr18对线虫的毒杀机理，本研究在此基础上，选定松材线虫（以下简称“线虫”）为试验对象，研究了Sr18菌代谢产物在8 h内对线虫体内总蛋白质含量、保护酶（SOD、CAT）活性、神经系统关键酶（TChE）活性和能量产生关键酶（ATP酶）活性的影响，为利用该菌研究和开发微生物源杀线剂奠定理论基础，同时为生物防控线虫提供了新的途径和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

Sr18菌种由天津师范大学生命科学学院提供。27 ℃，在PS液体培养基中震荡培养4 d后，过滤去掉菌体，收集培养液。线虫由中国林科院森环森保所提供。线虫用以察氏培养基培养的灰葡萄孢菌 （Batrytis cinerea， BC菌） 避光（26±1） ℃饲养5～7 d。

1.2 试验方法

1.2.1 线虫处理方法 采用浸渍处理法。在（26±1）℃的环境下，67 mL Sr18菌代谢产物中加入约100 000条线虫，然后分别处理0、2、4、6、8 h。在相应PS液体培养基中加入等量的线虫作为对照。

1.2.2 生理生化指标的测定 分别于试验设定的时间内将浸渍处理后的线虫离心收集，置于预冷的灭菌匀浆器中，加入4 mL预冷匀浆缓冲液，反复冻融3次[7]，然后冰上匀浆15 min，浆液进行超声破碎（破碎条件为超声破碎10 s，间隔30 s，共30次，功率400 W[8]）。破碎产物以3 000 r/min，4 ℃离心20 min，收取离心后的上清液即为总蛋白质样品。

蛋白质含量测定采用考马斯亮兰G250染色法；过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性测定参照文献[9]；乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AchE）、超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）、超微量ATP酶活性测定采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒。

2 结果与分析

2.1 Sr18菌代谢产物对线虫体内蛋白质含量的影响

Sr18菌代谢产物在不同时间对线虫体内蛋白质含量的影响见图1。由图1可知，在处理2 h左右，Sr18菌代谢产物处理的线虫体内总蛋白质含量和对照相比没有明显差异，当处理时间延长到3～4 h，可以检测到Sr18菌代谢产物处理的线虫体内总蛋白质含量急剧升高至0.544 2 mg/mL，而且明显高于正常培养情况下的线虫体内总蛋白质含量0.429 1 mg/mL。在4～6 h，Sr18菌代谢产物处理的线虫体内总蛋白质量急剧下降，与对照组线虫的总蛋白质含量相比没有明显差异。随着处理时间的延长，Sr18菌代谢产物处理的线虫体内总蛋白质含量和对照组逐渐趋于一致。各项数据表明，在短时间内，线虫对于Sr18菌代谢产物具有一个明显的应激反应，这主要表现为短时间内蛋白质大量的合成和降解。

2.2 Sr18菌代谢产物对SOD活性的影响

Sr18菌代谢产物在不同时间对线虫体内SOD活性的影响见图2。由图2可知，在0～4 h内，Sr18菌代谢产物处理的线虫体内SOD活性没有明显的变化，但对照组的SOD活性有一个明显升高和下降的改变。在4～8 h内Sr18菌代谢产物处理的线虫体内SOD活性和相应对照组SOD活性的变化趋势基本保持一致。从总体SOD活性高低来看，Sr18菌代谢产物处理的线虫体内SOD活性在处理时间内明显低于对照组。这表明，Sr18菌代谢产物具有抑制线虫体内SOD活性的功能。

2.3 Sr18菌代谢产物对CAT活性的影响

Sr18代谢产物在不同时间对线虫体内CAT活性的影响见图3。由图3可知，处理组和对照组线虫体内CAT活性，随处理时间的不同在8 h内的变化规律基本相似。即在0～2 h内呈上升趋势，在2～8 h呈下降趋势。在2～4 h内处理组与对照组相比CAT活性急速下降，说明Sr18菌代谢产物抑制了CAT的活性，但4 h后，CAT活性的下降趋于平缓，说明随处理时间的增加CAT活性受抑制程度基本相同即达到了最大效果。

当线虫体内的CAT活性被抑制时，会使线虫体内广泛存在的活性氧暴增，导致自由基增多，造成对细胞结构的损伤，特别是生物膜中不饱和脂肪酸的过氧化作用导致机体内过氧化脂质生成，致使细胞膜的流动性降低，核酸和染色体被破坏[10，11]。

2.4 Sr18菌代谢产物对TChE活性的影响

Sr18菌在不同时间对线虫体内TChE活性的影响见图4。由图4可知，处理组和对照组的线虫体内TChE活性的变化趋势基本相同，维持在相对稳定的状态。但处理的线虫体内TChE活性始终低于对照的线虫，这说明Sr18菌代谢产物对TChE有显著的抑制作用，且随着时间的变化，TChE活性受抑制程度基本相同。

2.5 Sr18菌代谢产物对线虫体内ATP酶活性的影响

Sr18代谢产物在不同时间对线虫体内ATP活性的影响见图5。由图5可知，处理组和对照组的线虫，在0～6 h这段时间内，体内ATP酶活性维持在相对稳定的状态。处理组线虫体内ATP酶活性低于对照组，说明Sr18代谢产物抑制了ATP酶的活性。但处理的线虫在8 h时，体内ATP酶的活性显著降低，表明长时间处理能更大限度地抑制ATP酶地活性。

3 小结与讨论

3.1 Sr18菌代谢产物对线虫体内蛋白质含量有较大影响

Sr18菌代谢产物对线虫体内蛋白质含量有重要的影响，在4 h时，处理组总蛋白质含量与对照组相比有显著差异，4 h时处理组比对照组的线虫明显活跃，这可能与4 h时总蛋白质的含量陡增有关。而在其他时间则基本保持一致，在2～4 h这段时间内处理组线虫在逆境情况下可能发生相应的应激反应，合成某些新的蛋白质来抵抗不利的外界环境，但随着处理时间的增加含量逐渐降低，这可能是处理组线虫体内的某些蛋白质在代谢产物处理过程中分解受阻，在体内大量积累，但随着处理时间的加长蛋白质分解又恢复正常所造成的。有关更深层次的原因有待进一步研究。

3.2 Sr18菌代谢产物对线虫体内SOD、CAT活性的影响

Sr18菌代谢产物对线虫体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响结果看，处理组和对照组线虫体内SOD活性在8小时内的变化规律基本相似，即先呈下降趋势后呈上升趋势。在整个变化过程中处理组SOD活性明显低于对照组，表明菌代谢产物抑制线虫体内SOD的活性。但由于处理后的线虫体内的SOD活性受抑制，不能及时有效的清除氧自由基，从而造成超氧阴离子的大量堆积，对线虫机体造成毒性，干扰细胞正常的生理代谢，从而破坏线虫了抗氧化保护酶系[12]。

试验结果表明，Sr18菌代谢产物能显著抑制线虫的SOD和CAT活性，对线虫机体造成毒性，使线虫体内广泛存在的活性氧暴增，导致自由基增多，使细胞膜产生过氧化，导致细胞膜破坏和损伤[10，11]，最终导致线虫死亡。

3.3 Sr18菌代谢产物对线虫体内TChE、ATP酶活性的影响

在Sr18菌代谢产物对线虫体内TChE活性试验中，中毒线虫起初表现为虫体扭曲、颤抖、痉挛，接着线虫游动缓慢、扭动身躯，最后反应迟钝、偶尔扭动身躯，直至死亡，虫体僵直。由此可以推测，Sr18菌代谢产物对线虫体内TChE活性的显著抑制，导致乙酰胆碱积累，造成突触间隙的乙酰胆碱持续处于高浓度，使突触后膜上的乙酰胆碱受体长时间处于活化状态，从而阻断了神经传递，引起中毒反应[13]。

从试验结果看，在8 h时ATP酶活性具有突然显著降低（ATP酶是能量转换的关键酶，可分解ATP成ADP和Pi，放出大量的能量），有可能是由乙酰胆碱的积累造成线虫机体过度兴奋，能量供给不上，造成线虫痉挛、麻痹，影响了线虫体内的正常代谢，从而影响其生命力，严重时导致线虫死亡。由此，可推测Sr18菌代谢物活性物质具有神经递质抑制作用，这一点从Sr18菌代谢物活性物质的室内杀线虫活性测定得到证实，因为作用于神经系统的物质，其毒杀作用的特点是快速击倒和杀死作用，而Sr18菌代谢物活性物质对松材线虫处理24 h死亡率达100%[6]。

综上所述，Sr18菌代谢产物的活性物质对这4种酶都有不同程度的抑制作用，这说明Sr18菌代谢产物对线虫的致死作用有可能是综合性的，是通过不同方面和不同系统作用的结果，它们之间是相互关联和相互影响，而有关更深层次的问题有待进一步研究。

参考文献：

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[13] 翁群芳，钟国华，胡美英，等.骆驼蓬提取物对松材线虫的生物活性及生理效应[J].中国农业科学，2005，38（10）：2014-2022.

在Sr18菌代谢产物对线虫体内TChE活性试验中，中毒线虫起初表现为虫体扭曲、颤抖、痉挛，接着线虫游动缓慢、扭动身躯，最后反应迟钝、偶尔扭动身躯，直至死亡，虫体僵直。由此可以推测，Sr18菌代谢产物对线虫体内TChE活性的显著抑制，导致乙酰胆碱积累，造成突触间隙的乙酰胆碱持续处于高浓度，使突触后膜上的乙酰胆碱受体长时间处于活化状态，从而阻断了神经传递，引起中毒反应[13]。

从试验结果看，在8 h时ATP酶活性具有突然显著降低（ATP酶是能量转换的关键酶，可分解ATP成ADP和Pi，放出大量的能量），有可能是由乙酰胆碱的积累造成线虫机体过度兴奋，能量供给不上，造成线虫痉挛、麻痹，影响了线虫体内的正常代谢，从而影响其生命力，严重时导致线虫死亡。由此，可推测Sr18菌代谢物活性物质具有神经递质抑制作用，这一点从Sr18菌代谢物活性物质的室内杀线虫活性测定得到证实，因为作用于神经系统的物质，其毒杀作用的特点是快速击倒和杀死作用，而Sr18菌代谢物活性物质对松材线虫处理24 h死亡率达100%[6]。

综上所述，Sr18菌代谢产物的活性物质对这4种酶都有不同程度的抑制作用，这说明Sr18菌代谢产物对线虫的致死作用有可能是综合性的，是通过不同方面和不同系统作用的结果，它们之间是相互关联和相互影响，而有关更深层次的问题有待进一步研究。

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在Sr18菌代谢产物对线虫体内TChE活性试验中，中毒线虫起初表现为虫体扭曲、颤抖、痉挛，接着线虫游动缓慢、扭动身躯，最后反应迟钝、偶尔扭动身躯，直至死亡，虫体僵直。由此可以推测，Sr18菌代谢产物对线虫体内TChE活性的显著抑制，导致乙酰胆碱积累，造成突触间隙的乙酰胆碱持续处于高浓度，使突触后膜上的乙酰胆碱受体长时间处于活化状态，从而阻断了神经传递，引起中毒反应[13]。

从试验结果看，在8 h时ATP酶活性具有突然显著降低（ATP酶是能量转换的关键酶，可分解ATP成ADP和Pi，放出大量的能量），有可能是由乙酰胆碱的积累造成线虫机体过度兴奋，能量供给不上，造成线虫痉挛、麻痹，影响了线虫体内的正常代谢，从而影响其生命力，严重时导致线虫死亡。由此，可推测Sr18菌代谢物活性物质具有神经递质抑制作用，这一点从Sr18菌代谢物活性物质的室内杀线虫活性测定得到证实，因为作用于神经系统的物质，其毒杀作用的特点是快速击倒和杀死作用，而Sr18菌代谢物活性物质对松材线虫处理24 h死亡率达100%[6]。

综上所述，Sr18菌代谢产物的活性物质对这4种酶都有不同程度的抑制作用，这说明Sr18菌代谢产物对线虫的致死作用有可能是综合性的，是通过不同方面和不同系统作用的结果，它们之间是相互关联和相互影响，而有关更深层次的问题有待进一步研究。

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