南方红豆杉紫杉醇产生菌的分离与鉴定

余响华+沈玉平+刘小文+张祖娇

摘要：从南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）根部树皮内表皮中分离得到69株内生真菌，通过HPLC检测发酵液中紫杉醇含量，共获得7种紫杉醇产生菌，同时，通过形态学分析以及ITS序列分析确定分别属于链格孢属（Alternaria）、葡萄孢盘菌属（Botryotinia sp.）、刺盘孢属（Colletotrichum）、拟茎点霉属（Phomopsis）和枝孢菌（Cladosporium），其中链格孢属真菌紫杉醇产量最高，平均为271.54 μg/L，是目前见诸报道的产量最高的链格孢菌，亦是从红豆杉根部树皮中筛选出的紫杉醇产量较高的野生菌株之一。该菌株的发现为紫杉醇高产菌的选育提供了又一优良的种质资源。

关键词：紫杉醇；南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）；内生真菌；ITS序列；HPLC

中图分类号：Q946.8；Q93-331 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）19-4552-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.011

Isolation and Identification of Endophytic Fungus Producing Paclitaxel

from Taxus chinensis var. mairei

YU Xiang-hua， SHEN Yu-ping， LIU Xiao-wen， ZHANG Zu-jiao

（Department of Life Science & Chemical Engineering， Hunan University of Science and Engineering ，Yongzhou 425100，Hunan， China）

Abstract： 69 strains of endophytes were isolated from root skin of Taxus chinensis var. mairei， which were belonged to 16 genera（groups） according to their morphological character. HPLC method was used to detect the concentration of paclitaxel in ferment. 7 strains were detected with the ability to synthesize paclitaxel. Combined with ITS sequence analysis， these 7 strains were identified as Alternaria、Botryotinia、Colletotrichum、Phomopsis and Cladosporium sp. The Alternaria sp. had the highest paclitaxel productivity， with the average up to 271.54 μg/L. It will provide another resource for selecting of high-yield strain of paclitaxel.

Key words： paclitaxel； Taxus chinensis var. mairei； endophytic fungi； ITS； HPLC

紫杉醇（Paclitaxel，商品名Taxol）是一种具有广谱抗癌活性的三环二萜类化合物，1971年从太平洋短叶红豆杉（Taxus brevifolia）中分离获得[1]，Schiff等[2]随后证实紫杉醇具有独特的抗癌机制。采用微生物发酵法，即从红豆杉植物中寻找紫杉醇产生菌并加以菌种改良，结合微生物发酵技术以提高产量，是目前公认的环境友好、成本低廉的解决紫杉醇生产原料来源危机的好方法[3]。

自1993年Stierle等[4]从太平洋短叶红豆杉树皮中分离出可产紫杉醇内生真菌以来，国内外学者相继开展了筛选产紫杉醇内生真菌的研究，到目前为止，人们已发现了20多个属的内生真菌可以产生紫杉醇[5]，分离部位大部分取自树干和树枝。本研究从南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）根部采集树皮，从中分离筛选内生真菌，测定其产紫杉醇性能，以及通过形态特征和ITS序列分析对其进行了分类。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）根部树皮，来源于湖南省永州市阳明山国家森林公园内的野生红豆杉，样品采集后迅速装入无菌塑料袋中，4 ℃保存。

1）培养基。固体培养基为PDA培养基，琼脂 2.0%，灭菌后冷却至40～50 ℃ 加入 25 mg/L链霉素，半固体培养基琼脂浓度减半。液体种子培养基：PDA培养基不加琼脂。发酵培养基（g/L）[6]：葡萄糖 1.0，果糖3.0，蔗糖6.0，醋酸钠1.0，酵母粉0.5，MgSO4 0.36，KH2PO4 0.5，乙酸钠2.0，ZnSO4 2.5×10-3，MnSO4 0.5×10-3，Cu（NO3）2 0.65，KCl 0.06，Ca（NO3）2 2×10-3， FeCl2 2×10-3，苯丙氨酸 5×10-3，苯甲酸钠 0.5，KH2PO4 0.136。

2）试剂。紫杉醇标准品（纯度>95%，Sigma）， HPLC 流动相甲醇为色谱纯， 水为三蒸水，Ezup柱式真菌基因组抽提试剂盒（SK8259） ，PCR Buffer（10×），dNTP（10 mol/L），Taq酶（5U/μL），引物：ITS1和ITS4（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ 和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，由上海铂尚生物合成）；其他试剂均为国产分析纯。

3）仪器。日本岛津LC-10ATvP高效液相色谱仪、旋转蒸发仪、BIO-RAD PCR仪、恒温摇床。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离与纯化 将南方红豆杉树皮置于无菌条件下，剥除根部外皮，留取内皮和韧皮部，切割成边长为0.5 cm×0.5 cm的正方形小块，用75%的乙醇表面消毒2～3 min，无菌水漂洗2～3次；滤纸吸干水分，斜插入半固体培养基中，每皿6～8块树皮，共50皿。28 ℃培养3～7 d，挑取自真皮向培养基基质生长的菌丝体微丝于固体培养基中，纯化2～3次，编号，保藏备用。

1.2.2 菌株的鉴定

1）形态学鉴定。将分离到的菌株于固体培养基，28℃恒温培养，每隔12 h记录菌落形态变化；显微形态观察采用插片法，40倍物镜；综合以上结果，依据菌落形态、菌丝体、孢子梗、营养细胞以及基质变化等特征，参考《真菌鉴定手册》进行鉴定[7]。

2）分子生物学鉴定。按上海生工SK8259真菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株基因组DNA，以此为模板扩增ITS序列（扩增条件：预变性94 ℃、5.0 mim； 94 ℃、30 S，55 ℃、35 S， 72 ℃、1.0 min， 35个 循环；72 ℃延伸 8.0 min）

测序由上海铂尚生物技术有限公司完成，所得序列经EMBL数据库中的BLAST比对分析，并利用DNAMAN和MEGA软件进行系统进化树分析。

1.2.3 发酵培养 28 ℃接种待培养菌株至固体培养基，培养4～5 d，无菌生理盐水洗下孢子，接种至20 mL装液量的液体种子培养基中，3皿/瓶，28 ℃、220 r/min培养14～16 h后，将液体种子以8%的接种量接种至发酵培养基中，28 ℃、200 r/min摇床培养7 d。

1.2.4 紫杉醇的提取 发酵液4 800 r/min离心 20 min，收集上清液；所得菌体沉淀以 20 000 r/min 匀浆 15～20 min，使目标产物充分释放，再离心；将两次上清液合并，双层滤纸过滤，滤液 50 ℃旋转蒸发浓缩至原体积的 1/10，加入等体积氯仿充分振荡进行萃取，共萃取两次，合并有机相，无水Na2SO4 干燥，35 ℃旋转蒸发至干，样品加少量甲醇溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤， 定容至10 mL 备用。

1.2.5 样品中紫杉醇含量的检测

1）标准溶液配制。精确称取紫杉醇标准品1.0 mg， 用10 mL甲醇溶解，配成100 mg/L母液备用。将母液稀释成5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 mg/L系列浓度的标准溶液。

2）色谱条件。日本岛津LC-10ATvP高效液相色谱仪，Kromstar C18 柱（250 mm×4.6 mm）；流动相， 甲醇∶水（V/V） =65∶35；流速1.0 mL/min， 检测波长227 nm， 柱温28 ℃， 进样量10 μL。

2 结果与分析

2.1 内生真菌的分离及形态学鉴定

从南方红豆杉树皮中分离出69株内生真菌， 依据形态学鉴定，确定其分属16属。每个属中挑选生长性状优良的菌株，进行液体发酵培养，测定其发酵物的紫杉醇含量，相同种属菌株取紫杉醇产量平均值，未检出者则视为无效菌株，不在表内列出。共获得7株产紫杉醇菌株，对应的鉴定结果及紫杉醇产量见表1。

2.2 紫杉醇含量的检测

2.2.1 标准曲线的制作 取所配的紫杉醇标准品溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线，回归方程为■=16 518x-9475.1，r2= 0.998 1。结果表明，回归方程在0～40 mg/L范围内线性关系良好（图1）。

2.2.2 发酵液中紫杉醇的检测 紫杉醇标准品和链格孢属菌株（YEP751）发酵提取物的HPLC检测结果见图2和图3。在相同色谱条件下，紫杉醇标准品的保留时间为23.574 min，菌株发酵浓缩液在此时间处有一明显对应峰，即检测到菌株代谢产物中含有紫杉醇。

2.3 紫杉醇产生菌的分子生物学鉴定

菌株YEP731、YEP822和YEP751 的ITS扩增序列分别为564、599、532 bp，该序列在EMBL数据库中经BLAST比对，显示与链格孢属真菌（Alternaria sp.）有极高的同源性（99%），系统进化树（图4） 结果亦表明这3株菌株与链格孢属真菌的亲缘关系最近；菌株YEP821与葡萄孢盘菌属真菌（Botryotinia sp.）的ITS序列有99%的一致性；菌株YEP742与葡萄刺盘孢属真菌（Colletotrichum sp.）的ITS序列有99%的一致性；菌株YEP442与拟茎点霉属（Phomopsis sp.）的ITS序列有99%的一致性；菌株YEP611与枝孢菌属真菌（Cladosporium sp.）的ITS序列有99%的一致性。上述相关序列均在ENA（European Nucleotide Archive）完成注册，相应EMBL登录号为HG530662-HG530668。

3 讨论

本试验从南方红豆杉的根部树皮中分离得到69株内生真菌，形态学鉴定其分属16属， 通过HPLC法检测发酵物中紫杉醇的含量， 发现有7株菌株能够产生紫杉醇， 再经过ITS序列分析确定分别属于链格孢属（Alternaria）、葡萄孢盘菌属（Botryotinia）、刺盘孢属（Colletotrichum）、拟茎点霉属（Phomopsis）和枝孢菌属（Cladosporium）。 其中链格孢属真菌（Alternaria）平均产量为271.54 μg/L（其中一株产量更是高达303.06 μg/L），是目前见诸报道的产量最高的链格孢菌[8-11]，亦是从红豆杉根部树皮中筛选出的紫杉醇产量较高的野生菌株之一[5]。随着后续研究的跟进，其紫杉醇产量有望跃上一个新台阶。

参考文献：

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[4] STIERLE A，STROBEL G A，STIERLE D. Taxol and taxane production by taxomyces andreanae，an endophytic fungus of pacific yew[J]. Science，1993，260：214-216.

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