检测汞的全细胞生物传感器构建

杨锋+齐显尼+王钦宏+张雪洪

摘 要：汞（Hg）是环境中主要的重金属污染物，暴露于环境中的汞对人体健康有严重危害。汞的精确检测对控制环境污染和减少对健康的危害有着重要意义。该实验是基于MerR蛋白调节的启动子对应答汞毒性基因的调控机理，首先通过试验确定红色荧光蛋白mCherry为报告基因。将MerR基因片段链接到质粒pUC57得到质粒pUC57-MerR，以其为模版得到质粒pUCRR，转入到E. coli DH5α中，得到工程菌株E. coli UCRR。为提高菌株的性能和灵敏度，通过易错PCR技术获得MerR基因突变体库，筛选出菌株V109E在培养4 h时，荧光信号强度远远高于其他菌株荧光信号，对Hg2+有高度专一性，检测Hg2+的最低浓度为0.5nM。

关键词：汞检测 全细胞生物传感器 MerR蛋白 易错PCR

中图分类号：R3 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）08（c）-0205-05

The Construction of Whole-Cell Biosensors for Monitoring Mercury

Abstract：Mercury has been well known as an environmental pollutant for several decades. Emissions of mercury to the environment could have serious effects on human health. To control mercury pollution and reduce mercury damage to human health， sensitive determination of mercury is important. Our biosensor design for mercury detection was based on MerR whice is an activator that controls genes involved in the response to mercury poisoning. we selected mCheery out for fluorescent detection signal ，Then cloned MerR into pUC57 to obtain pUC57-MerR， and utilized pUC57-MerR as a template to obtain the recombinant plasmid pUCRR. This plasmid was transformed into E. coli DH5α in order to obtain engineered strain E. coli UCRR. We established a library of mutated MerR gene by Error-prone PCR in order to improve MerR protein derived biosensors to detect and monitor mercury more efficiently and with higher sensitivity. The mutant MerR genes V109E which have improved functionalities been selected. V109E had highest sensitivity increasing than other mutated mercury biosensors after 4-hour incubation time.The whole-cell biosensors based on V109E had high sensitivity and Specificity， the lowest concentration of mercury detection had reached to 0.5nM.

Key words： Mercury detection Whole-cell biosensors MerR protein Error-prone PCR

1 前言

汞（Hg）是自然界唯一以液态形式存在的金属，0℃时汞即可挥发为汞蒸汽，并可随大气循环长距离跨界污染，是除温室气体外对全球环境造成严重影响的化学物质之一，国际环境规划署已将其列为全球性污染物[1]。

准确检测和监控环境中，特别是水域中的汞对于人们的日常生产和生活有着重要意义。现有各种检测汞的常规技术手段及装置，如原子吸收光谱法、原子发射光谱法、原子力学光谱法和电感耦合等离子体质谱法，具有很好的灵敏性，但是这些检测手段和装置的使用具有极大的局限性，即设备价格昂贵，都需要将待测样品转化为汞原子，同时需要培训专业人员来操作[2]。更为重要的是这些检测方法都不能测定汞污染的生物可利用浓度（Bioavailable concentration）。基于此原因，近年来开发生物传感器检测汞及其他金属污染物越来越受到人们的高度重视。

生物传感器是一种分析检测装置，通常由一个固定化的生物材料紧密地与一个与之兼容的传感器所组成，能把生物信号转换为易于量化的电信号。生物传感器在对环境污染物进行监测时，有体积小、简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点，还可原位在线分析。

MerR家族转录激活子的原型来自于革兰氏阴性细菌汞抗性（mer）操纵子中的调节因子，通常在转座子Tn21和Tn501中存在[3]。各种荧光蛋白（如emGFP，eYFP，eBFP或mCherry）可以作为易于检测的报告基因，可以与MerR或MerR类蛋白调节的启动子相融合，构建后的重组细菌与汞离子接触后能够产生可以定量检测的荧光信号[4]（图1）。endprint

准备高质量的遗传改造生物传感器用于检测重金属的关键因素是依赖金属结合蛋白的专一性和亲和性。应用蛋白质定向进化和高通量筛选技术，通过MerR的定向进化和筛选，可以得到一些性能改变的MerR突变体[5-7]。在汞离子存在时，这些突变蛋白的产生能快速增加荧光蛋白基因的表达。

该实验旨在利用金属调节蛋白MerR和红色荧光蛋白mCherry，结合合成生物学和蛋白质定向进化技术，构建新一代高灵敏、专一性的检测汞的全细胞生物传感器。

2 构建检测汞的全细胞传感器

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.1.1 菌种和质粒

本试验所用菌株和质粒如表1。

2.1.1.2 培养基

LB培养基，LB固体培养基，5×M9盐溶液，M9基本培养基，M9CA培养基， M9CAG培养基。

2.1.1.3 实验仪器及设备

酶标仪（美国Molecular Devices）；涡旋混匀器（美国精骐）；恒温振荡器（美国精骐）；恒温培养箱（上海志成）；立式超低温保存箱（中国青岛海尔）；可见光凝胶投射仪（北京百泰克公司）；电泳仪（美国BioRad）；PCR仪（美国BioRad）；96孔普通酶标板、2 mL96孔深孔板（Thermo fisher scientific） 。

2.1.2 实验方法

MerR基因序列PCR扩增，PCR产物的电泳检测，MerR基因扩增片段的回收；感受态制备E.coli DH5α，目的片段与pUC19载体相连，化学法转化，挑取阳性克隆进行验证；生物传感器测定Hg2+含量。采用易错PCR方法对MerR基因进行定向进化，构建文库，并结合mCherry基因，通过荧光信号强弱和颜色反应筛选最佳生物传感器。

2.2 结果与讨论

2.2.1 最佳荧光蛋白信号的选择

本实验选取四种荧光蛋白，即红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白。四种荧光蛋白基因链接到pUC19质粒中，得到质粒pUC19R、pUC19G、pUC19Y、pUC19B，再转入到E.coli DH5α感受态细胞中。将获得的单克隆接种到LB、M9CA和M9CA+0.4%Glucose培养基中，测得荧光信号。从图2中可以看出，绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白的荧光信号背景值较大，红色荧光蛋白mCherry的背景值最小。因此本实验选取mChreey蛋白用于以后实验。

2.2.2 生物传感器的构建

本试验所用基因MerR由华大基因合成，全长720bp，包括MerR编码基因序列、MerR和MerT的启动子以及MerT基因，并将片段链接到质粒pUC57得到质粒pUC57-MerR，以质粒pUC57-MerR为模版，利用高保证酶TransStartTM FastPfu DNA聚合酶进行MerR基因PCR扩增。利用SphI和NotI双酶切将pUC19R质粒的T7启动子用MerR基因替换，得到质粒pUCRR，将质粒转入到E. coli DH5α中，得到工程菌株E. coli UCRR（图3）。

2.2.3 MerR基因突变文库构建

利用epPCR得到含有突变位点的MerR基因之后转入到pUC19R，之后利用含有Hg2+的LB培养基进行筛选，得到荧光信号强度较高的菌株，如图4所示。

2.2.4 突变文库的筛选

从图5中可以看出，单菌株呈现不同程度的红色，这是由于通过epPCR得到的突变MerR基因，某些氨基酸发生改变，导致重组菌株对Hg2+检测的灵敏度发生变化，颜色越深表示对Hg2+ 的灵敏度越高。挑选颜色较深的菌株进行进一步筛选，得到最佳菌株。

基于颜色反应平板筛选和液体培养筛选，5000个突变体中筛选出22个突变菌株。得到的22株菌对Hg2+有较高的灵敏度。通过测序得知22菌株中，MerR基因均有氨基酸发生改变。如图6所示，发生变化的氨基酸标注在MerR蛋白序列中，其中黑色部分是DNA结合区域（1～29），有2个位点的氨基酸发生改变，15位的赖氨酸变成谷氨酸，16位的丙氨酸变成缬氨酸；蓝色部分为偶联结合区域（30～81），连着DNA结合区域和Hg2+结合区域，这个区域有7个位点发生氨基酸改变，其中72位和77位突变氨基酸相同，都是谷氨酸变成赖氨酸，在74位置，有2菌株都发生改变，有亮氨酸分别变成了谷氨酰胺和缬氨酸，；绿色部分为Hg2+结合区域（82～117），这个区域7个氨基酸发生改变，在99位点出，有3菌株发生氨基酸改变，均有赖氨酸分别变成天冬氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸，109位点有2菌株都发生改变，缬氨酸分别变成谷氨酸和蛋氨酸；在Hg2+结合区域下游部分同样有5个位点发生氨基酸改变。

将22菌株接种到M9、M9CA、M9CAG和LB培养基中，测定红色荧光信号。从图7中可以看出，与原始菌株相比，22菌株的荧光信号均高于原始菌株。其中16、66、80、86位点以及125位点（丝氨酸变成苏氨酸）发生氨基酸突变的菌株的荧光信号较弱，说明氨基酸改变没有使得菌株对Hg2+的灵敏度增加；与原始菌株相比，15、56位点氨基酸的改变使得菌株的荧光信号显著增强；74位点有2菌株的MerR基因发生改变，其中亮氨酸变成谷氨酰胺的改变使得菌株荧光信号增强的幅度较大；99位点处有3菌株的MerR基因发生突变，其中变成天冬氨酸和谷氨酰胺的菌株荧光信号增强的幅度较大；109位点有2菌株的MerR基因发生改变，与所有突变菌株相比，缬氨酸变成谷氨酸菌株的荧光信号增强程度最大；124和125位点均有2菌株的MerR基因发生改变，其中缬氨酸变成天冬氨酸，丝氨酸变成脯氨酸菌株的荧光信号增强幅度较大。

从图7中还可以看出，同一突变体菌株在不同培养基中培养，其荧光信号同样存在差异，其中M9培养基培养菌株测得的荧光信号较弱，LB培养基培养菌株测得的荧光信号较强。endprint

2.2.5 突变菌株对Hg2+专一性评价

从筛选的22突变菌株挑选7菌株，分别记作K15E、F56L、L74Q、V109E、V124D、S125P和K99N。将选取7株菌和原始菌株在LB培养之后，分别加入浓度为1000nM的金属离子溶液，分别是MnCl2、ZnCl2、FeCl3、CuCl2、NiCl2、CoCl2、MoCl2、CrCl3、CdCl2、PbCl2和HgCl2。从图8可以看出，原始菌株和7株MerR突变菌株仅在有HgCl2存在情况下产生荧光信号，说明菌株原始MerR基因和发生突变的MerR基因对Hg2+有较高的专一性。

2.2.6 突变菌株对Hg2+反应时间评价

利用菌株检测Hg2+含量，诱导时间不同能够影响检测结果的准确性。从图9可以看出，在不同反应时间内，产生的荧光信号强弱不同。在2 h时，菌株K15E的荧光信号最强，菌株K99S的荧光信号最弱，说明菌株K15E能够在最短时间内对Hg2+检测；4 h时，菌株V109E的荧光信号强度远远高于其他菌株，其次是S125P，菌株K99S的荧光信号依然最弱，说明随着时间进行，菌株V109E荧光信号增强最大。说明检测Hg2+含量时，反应时间为4 h为最佳，此时菌株产生的荧光信号将强，易于减小检测的误差，保证检测结果准确性。

2.2.7 突变菌株对Hg2+浓度评价

从图10可以看出，在Hg2+浓度为0.5nM和1.0nM时，原始菌株没有产生荧光信号，说明原始菌株不能检测低浓度的Hg2+（1.0nM以下）。MerR基因突变菌株在0.5nM和1.0nM时，均能够产生显著的荧光信号，其中菌株V109E荧光信号最强，其次是S125P，菌株K99N的荧光信号最弱。说明突变菌株能够检测Hg2+的最低浓度为0.5nM，具有较低的检测限对于Hg2+检测的准确性有很大意义。

3 结语

该试验选取红色荧光蛋白mCherry为报告基因。将MerR基因与mCherry基因链接形成的基本构造生物传感器。通过易错PCR技术构建突变文库，从 5000个突变体中22个MerR基因突变菌株对Hg2+具有较高的专一性；其中菌株V109E荧光信号增强最大，且Hg2+的最低检出限可达0.5nM。通过突变菌株的Hg2+反应时间评价试验中，4 h时，菌株V109E的荧光信号强度远远高于其他菌株。说明检测Hg2+含量时，反应时间为4 h为最佳，最终获得了性能最佳的全细胞生物传感器。

参考文献

[1] 覃东立，姜秋俚，付友生.全球汞污染回顾与分析[J].环境保护科学，2009，35（4）：75-78.

[2] Knecht MR，Sethi M. Bio-inspired colorimetric detection of Hg2+ and Pb2+ heavy metal ions using Au nanoparticles[J].Anal Bioanal Chem，2009，394（1）：33-46.

[3] Nigel LB，Simon JF，Pridmore RD，et al. Nucleotide Sequence of a Gene from the Pseudomonas Transposon Tn501 Encoding Mercuric Reductaset[J].Biochemistry，1983（22）：4089-4095.

[4] Nathan C Shaner，Paul A Steinbach1，Roger Y Tsien1.A guide to choosing fluorescent proteins[J].NATURE METHODS，2005，12（2）：905-909.

[5] Ivask A，Green T，Polyak B. et al. Fibre-optic bacterial biosensors and their application for the analysis of bioavailable Hg and as in soils and sediments from aznalcollar mining area in Spain[J].Biosensors and Bioelectronics，2007，22（7）：1396-1402.

[6] Selifonova O，Burlage R. Bioluminescent sensors for detection of bioavailable Hg（II） in the environment[J].Applied and environmental microbiology，1993，59（9）：3083-3090.

[7] Petanen T，Romantschuk M.Use of bioluminescent bacterial sensors as an alternative method for measuring heavy metals in soil extracts[J].Analytica Chimica Acta，2002，456（1）：55-61.endprint

2.2.5 突变菌株对Hg2+专一性评价

从筛选的22突变菌株挑选7菌株，分别记作K15E、F56L、L74Q、V109E、V124D、S125P和K99N。将选取7株菌和原始菌株在LB培养之后，分别加入浓度为1000nM的金属离子溶液，分别是MnCl2、ZnCl2、FeCl3、CuCl2、NiCl2、CoCl2、MoCl2、CrCl3、CdCl2、PbCl2和HgCl2。从图8可以看出，原始菌株和7株MerR突变菌株仅在有HgCl2存在情况下产生荧光信号，说明菌株原始MerR基因和发生突变的MerR基因对Hg2+有较高的专一性。

2.2.6 突变菌株对Hg2+反应时间评价

利用菌株检测Hg2+含量，诱导时间不同能够影响检测结果的准确性。从图9可以看出，在不同反应时间内，产生的荧光信号强弱不同。在2 h时，菌株K15E的荧光信号最强，菌株K99S的荧光信号最弱，说明菌株K15E能够在最短时间内对Hg2+检测；4 h时，菌株V109E的荧光信号强度远远高于其他菌株，其次是S125P，菌株K99S的荧光信号依然最弱，说明随着时间进行，菌株V109E荧光信号增强最大。说明检测Hg2+含量时，反应时间为4 h为最佳，此时菌株产生的荧光信号将强，易于减小检测的误差，保证检测结果准确性。

2.2.7 突变菌株对Hg2+浓度评价

从图10可以看出，在Hg2+浓度为0.5nM和1.0nM时，原始菌株没有产生荧光信号，说明原始菌株不能检测低浓度的Hg2+（1.0nM以下）。MerR基因突变菌株在0.5nM和1.0nM时，均能够产生显著的荧光信号，其中菌株V109E荧光信号最强，其次是S125P，菌株K99N的荧光信号最弱。说明突变菌株能够检测Hg2+的最低浓度为0.5nM，具有较低的检测限对于Hg2+检测的准确性有很大意义。

3 结语

该试验选取红色荧光蛋白mCherry为报告基因。将MerR基因与mCherry基因链接形成的基本构造生物传感器。通过易错PCR技术构建突变文库，从 5000个突变体中22个MerR基因突变菌株对Hg2+具有较高的专一性；其中菌株V109E荧光信号增强最大，且Hg2+的最低检出限可达0.5nM。通过突变菌株的Hg2+反应时间评价试验中，4 h时，菌株V109E的荧光信号强度远远高于其他菌株。说明检测Hg2+含量时，反应时间为4 h为最佳，最终获得了性能最佳的全细胞生物传感器。

参考文献

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2.2.5 突变菌株对Hg2+专一性评价

从筛选的22突变菌株挑选7菌株，分别记作K15E、F56L、L74Q、V109E、V124D、S125P和K99N。将选取7株菌和原始菌株在LB培养之后，分别加入浓度为1000nM的金属离子溶液，分别是MnCl2、ZnCl2、FeCl3、CuCl2、NiCl2、CoCl2、MoCl2、CrCl3、CdCl2、PbCl2和HgCl2。从图8可以看出，原始菌株和7株MerR突变菌株仅在有HgCl2存在情况下产生荧光信号，说明菌株原始MerR基因和发生突变的MerR基因对Hg2+有较高的专一性。

2.2.6 突变菌株对Hg2+反应时间评价

利用菌株检测Hg2+含量，诱导时间不同能够影响检测结果的准确性。从图9可以看出，在不同反应时间内，产生的荧光信号强弱不同。在2 h时，菌株K15E的荧光信号最强，菌株K99S的荧光信号最弱，说明菌株K15E能够在最短时间内对Hg2+检测；4 h时，菌株V109E的荧光信号强度远远高于其他菌株，其次是S125P，菌株K99S的荧光信号依然最弱，说明随着时间进行，菌株V109E荧光信号增强最大。说明检测Hg2+含量时，反应时间为4 h为最佳，此时菌株产生的荧光信号将强，易于减小检测的误差，保证检测结果准确性。

2.2.7 突变菌株对Hg2+浓度评价

从图10可以看出，在Hg2+浓度为0.5nM和1.0nM时，原始菌株没有产生荧光信号，说明原始菌株不能检测低浓度的Hg2+（1.0nM以下）。MerR基因突变菌株在0.5nM和1.0nM时，均能够产生显著的荧光信号，其中菌株V109E荧光信号最强，其次是S125P，菌株K99N的荧光信号最弱。说明突变菌株能够检测Hg2+的最低浓度为0.5nM，具有较低的检测限对于Hg2+检测的准确性有很大意义。

3 结语

该试验选取红色荧光蛋白mCherry为报告基因。将MerR基因与mCherry基因链接形成的基本构造生物传感器。通过易错PCR技术构建突变文库，从 5000个突变体中22个MerR基因突变菌株对Hg2+具有较高的专一性；其中菌株V109E荧光信号增强最大，且Hg2+的最低检出限可达0.5nM。通过突变菌株的Hg2+反应时间评价试验中，4 h时，菌株V109E的荧光信号强度远远高于其他菌株。说明检测Hg2+含量时，反应时间为4 h为最佳，最终获得了性能最佳的全细胞生物传感器。

参考文献

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[4] Nathan C Shaner，Paul A Steinbach1，Roger Y Tsien1.A guide to choosing fluorescent proteins[J].NATURE METHODS，2005，12（2）：905-909.

[5] Ivask A，Green T，Polyak B. et al. Fibre-optic bacterial biosensors and their application for the analysis of bioavailable Hg and as in soils and sediments from aznalcollar mining area in Spain[J].Biosensors and Bioelectronics，2007，22（7）：1396-1402.

[6] Selifonova O，Burlage R. Bioluminescent sensors for detection of bioavailable Hg（II） in the environment[J].Applied and environmental microbiology，1993，59（9）：3083-3090.

[7] Petanen T，Romantschuk M.Use of bioluminescent bacterial sensors as an alternative method for measuring heavy metals in soil extracts[J].Analytica Chimica Acta，2002，456（1）：55-61.endprint