桑杏汤对两种细菌的最低抑菌浓度测定及意义

倪圣，丁建中，黄江荣，李侃

（长江大学医学院，湖北荆州434023）

桑杏汤出自清代医家吴瑭所著 《温病条辨》卷一之上焦篇方，“秋感燥气，右脉数大，伤手太阴气分者，桑杏汤主之。”此方轻宣温燥，凉润止咳，故能 “清气分之燥也”。近年来对桑杏汤及其加减方治疗呼吸系统疾病随机对照试验研究文献的Meta分析显示，对1310例肺炎、咳嗽变异性哮喘、咳嗽、支气管炎等受试者疗效良好［1－2］。前期研究证实桑杏汤可促进气道黏液分泌及增加气道IgG抗体水平，可能是治疗呼吸系统疾病的生物学基础之一［3］。本实验采用制备含桑杏汤复方水提取物琼脂平板法测定其对金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）和铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度（Minimum inhibition concentration，MIC），为解析桑杏汤治疗温燥伤肺机制提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

恒温培养箱，温度（6～65）±1℃（上海医疗器械厂）；细菌标准比浊管（DensiCHEK，BioMerieux.Inc，27704－0969／USA）；M－H 药 物 敏 感 试 验 琼 脂（批 号：20131114， 产 品 编 号：HB6232，青岛高科园海涛生物技术有限公司）；微量移液器（2～10μl，100μl，德国）。

1.2 实验菌种

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC29213）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC27853）质控菌株由原卫生部临床检验中心（NCCL）提供。

1.3 实验药材

桑杏汤源自 《温病条辨》：桑叶9g，杏仁9g，沙参15g，象贝母12g，香豉6g，栀子皮12g，梨皮12g。中药材购自湖北清大中药饮片有限责任公司，经湖北中医药大学药学院鉴定教研室鉴定为合格药材。

1.4 中药液制备

取桑杏汤一剂，加3倍水浸泡2h后微火煎至100ml，重复3次，3次煎液过滤混匀并水浴浓缩至200ml，其生药量为0.360g／L。待药液冷却至室温后3500r／min离心20min，取上清液备用。

1.5 菌液制备

取经BioMerieux专用培养基转种18h的金葡菌、铜绿假单胞菌用无菌生理盐水制成悬液，用细菌标准比浊管稀释至0.5麦氏浊度（1.5×108个／ml），当天使用。

1.6 含中药MH培养基制备

在多次预试验后，取MH琼脂、按表1配制不同浓度（mg／ml）的培养基，用1mol／L NaOH调整pH为7.4，经121℃、15min后备用；琼脂厚度4mm，常规检菌试验合格；对照组用无菌生理盐水代替药物。用记号笔在每个含药培养基底部标记分区以便接种细菌悬液。

表1 桑杏汤水提取物药物敏感试验培养基制备 最终生药浓度：mg／ml

1.7 最低抑菌浓度（MIC）测定

取0.1ml细菌悬液（1×108CFU／ml）于无菌EP管中经无菌生理盐水稀释为1×105CFU／ml，于每个培养基的3个分区分别接种2μl，经（36.5±0.5）℃、24h后，证实全部培养基无污染菌生长后，用细菌菌落计数器记数菌落，以完全抑制细菌生长浓度为 MIC，参照同类实验 MIC判断标准［5］：＜7.81mg／ml生药浓度为高度敏感，7.81～250.0mg／ml生药浓度为中度敏感，＞250.0mg／ml生药浓度时为不敏感［4］。每个试验重复3次，取均值。

1.8 细菌菌落鉴定

在确认无杂菌污染基础上进行革兰染色；对可疑金葡菌菌落进行血浆凝固酶试验：在盛有1∶4新鲜兔血浆0.5ml的试管中加入各平板生长24h可疑菌落制备的菌液0.5ml，摇荡均匀，放入（37±1）℃恒温箱中培养，每0.5h观察一次，连续观察6h，呈现凝块状为阳性；同时用金葡菌质控菌株和阴性肉汤作为对照。对铜绿假单胞菌采用革兰染色与菌落色素进行确认。

2 结果

桑杏汤水提取物对金葡球的MIC为25mg／ml，对绿脓假单胞菌的MIC为200mg／ml。见表1。

表2 桑杏汤水提取物对两种细菌的MIC值 mg／ml

3 讨论

革兰阳性金葡球在环境和人体体表、体内广泛存在，上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，通过其毒素和侵袭性酶引起肺炎、败血症等化脓性感染和医源性感染的主要细菌之一；革兰阴性铜绿假单胞菌在皮肤、呼吸道、肠道广泛存在，在机体抵抗力降低、长期应用激素或抗生素时易导致机会性感染，也是常见的医源性感染病原菌，故本实验采用上述两种病原菌进行MIC实验。鉴于国内尚无测定中草药对细菌MIC的统一标准，故本实验参照同类实验标准，首次测得桑杏汤水提取物对金葡菌和绿脓假单胞菌的MIC分别25mg／ml和200mg／ml（生药浓度），表明桑杏汤对革兰阳性细菌和革兰阴性细菌具有良好抑菌作用（或中度敏感），且对革兰阳性菌的抑制作用强于革兰阴性菌，其机理有待研究。

实验显示，当桑杏汤达到实验预先设计的0.360g／L水煎剂浓度时较为黏稠，采用0.45μm真空抽滤除菌法费时且需大量药液，又要兼顾根据实验要求精确制备在每个含15ml培养基中达到实验规定的中药生药浓度琼脂平板，优点是可在一个平板上同时检测两种细菌的MIC，方法简捷、直观、结果可靠并易发现污染菌，尤其是上述浓度制备的含药琼脂平板虽然具有一定颜色的浅棕色色素，但同时具有良好的透明度而能清晰、有效地进行菌落计数。制备含药琼脂平板缺点是费时费力，要考虑到中药复方水煎提取过程中产生复杂的化学反应，更受到制备MH琼脂需经高压灭菌处理等导致抗菌物质活性降低或有效成分被破坏，使其抑菌活性降低并导致MIC值偏高［6］，为进一步研究桑杏汤复方药物成分的“抗菌清热”作用机制和物质基础提供重要基础。

值得注意的是，在连续5次按照常规程序、将新制成的1×104CFU／ml细菌悬液用无菌微量移液器在每个接种点上接种2μl后，其结果是对照组与最低浓度生药组培养基上均无细菌菌落生长，但调至1×105CFU／ml、在每个点上接种2μl后生长良好且递度明显，故本实验采用的接种细菌悬液为1×105CFU／ml，此种改良方法对相关实验具有借鉴作用。

［1］赵勤，汪海飚，高振，等.桑杏汤（散）及其加减方治疗呼吸系统疾病疗效的系统评价 ［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（7）：254－258.

［2］王渝，陈妙.桑杏汤加减治疗咳嗽变异性哮喘临床观察 ［A］.海拉尔：全国中医内科肺系病第14次学术研讨会，2010：123.

［3］丁建中，张六通，龚权，等.桑杏汤对温燥小鼠气管纤毛运动与呼吸道液及免疫功能的影响 ［J］.中药药理与临床，2006，22（5）：4－5.

［4］中华人民共和国卫生部医政司.全国临床检验操作规程 ［M］.3版.南京：东南大学出版社，2006：896－905.

［5］高尚进，毛艳，周汉东，等.11种中草药对8种常见细菌的体外抑菌试验 ［J］.川北医学院学报，2008，23（5）：466－468.

［6］候家玉.中药药理学 ［M］.北京：中国中医药出版，2002：55.