PTTG1通过上皮-间质转化促进非小细胞肺癌的迁移和侵袭

李洪利，尹崇高

(潍坊医学院 1.医学研究实验中心; 2.护理学院，山东 潍坊 261053)

研究论文

PTTG1通过上皮-间质转化促进非小细胞肺癌的迁移和侵袭

李洪利1，尹崇高2*

(潍坊医学院 1.医学研究实验中心; 2.护理学院，山东 潍坊 261053)

目的研究PTTG1在非小细胞肺癌侵袭转移中的作用。方法应用免疫组织化学染色法检测80例NSCLC组织中PTTG1、E-cadherin和Vimentin的表达，并分析其相关性。细胞分组：1)A549/con，转染空载的A549，2)A549/PTTG1，转染目的基因的A549，3)Scr/H1299，转染空载的H1299，4)SiPTTG1/H1299，敲除PTTG1的H1299；用Western blot检测细胞中PTTG1、E-cadherin、Vimentin蛋白的表达情况。结果NSCLC组织中PTTG1蛋白的阳性表达率为85%与E-cadherin的表达呈负相关(Plt;0.05)而与Vimentin的表达呈正相关(Plt;0.05)。Western blot结果显示在SiPTTG1/H1299细胞中PTTG1蛋白表达水平明显降低，Vimentin蛋白表达水平降低而E-cadherin蛋白表达水平升高。同时在A549/PTTG1细胞中Vimentin蛋白表达水平升高而E-cadherin蛋白表达水平降低。结论PTTG1能促进NSCLC EMT的发生，从而促进NSCLC的侵袭和转移。

垂体肿瘤转化基因1；上皮-间质转化；肺肿瘤；侵袭

垂体肿瘤转化基因(pituitary tumor-transforming gene,PTTG)被证实与细胞增殖、分化和凋亡有关的癌基因，其家族包括PTTG1、PTTG2和PTTG3 3个成员。PTTG1是研究最多的，因此通常被称为PTTG[1]。本研究先前已证实PTTG1在NSCLC中的过度表达与淋巴结转移和远处转移有关，并可以通过多种机制影响NSCLC细胞的侵袭和转移并且其表达受miR-186调控[2]。而肿瘤的侵袭和转移的机制很多，PTTG1是否还能通过其他的分子机制影响NSCLC的转移有待于进一步的研究。

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指在某些生理或病理条件下，上皮细胞丧失细胞极性而获得间叶细胞特性的过程[3]。更多的研究已经表明EMT与许多肿瘤的侵袭和转移是相关的。那么，PTTG1是否也可以通过EMT从而影响NSCLC的侵袭和转移呢？本研究应从组织和细胞两个方面探讨PTTG1在NSCLC侵袭转移中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验标本：收集80例潍坊医学院附属医院手术切除NSCLC组织。所有病例经病理证实，患者术前均未接受放疗、化疗和免疫治疗。所有标本都取得了患者的知情同意。

1.1.2 主要试剂：PTTG1、E-cadherin、vimentin一抗(Santa Cruz公司)；小RNA干扰载体(上海吉玛制药技术有限公司构建)；pcDNA3.1-PTTG1载体(潍坊医学院医学研究实验中心)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色：染色方法，组织阳性结果判断参照参考文献[2]。

1.2.2 细胞培养及分组：H1299细胞常规培养于含10%胎牛血清的1640培养基中传代培养。细胞分为4组：1)瞬时转染插入空载质粒的H1299细胞称为Scr/H1299细胞；2)瞬时转染插入PTTG1目标片段5′-GAGAAGACUGUUAAAGCAATT-3′的H1299细胞称为SiPTTG1/H1299细胞。3)构建载体pcDNA3.1-PTTG1转染pcDNA3.1-PTTG1的A549细胞称为A549/PTTG1细胞；4)转染空载pcDNA3.1的A549细胞称为A549/con细胞。

1.2.3 Western blot检测各组细胞培养72 h后提取总蛋白。各组以等量蛋白被12%SDS-PAGE电泳分离后，按200 mA，2 h的条件湿转至PVDF膜上，封闭后加入相应一抗和二抗，用ECL发光剂显影，X胶片曝光。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1PTTG1、E-cadherin及vimentin在NSCLC表达的相关性分析

阳性染色颗粒呈棕黄色或棕褐色。PTTG1和vimentin定位于肿瘤细胞的胞质，而E-cadherin定位于肿瘤细胞的细胞膜。NSCLC组织中PTTG1的阳性表达率为85%(68/80)，E-cadherin的阳性表达率为66.2%(53/80)，vimentin的阳性表达率为36.2(29/80)。PTTG1在NSCLC中的表达与E-cadherin的表达呈负相关而与vimentin的表达呈正相关(Plt;0.05)(表1，图1)。

表1 PTTG1与E-cadherin及vimentin在NSCLC表达的相关性

*Plt;0.05 compared with negative expression of PTTG1.

2.2Westernblot检测肺癌组织及细胞系A549、H1299中PTTG1的表达

PTTG1蛋白质在NSCLC组织中的表达明显高于癌旁正常肺组织(图2A)。此外，PTTG1蛋白在高度侵袭性细胞H1299 中表达高而在低侵袭性的A549细胞中表达较低(图2B)。

A.positive expression of PTTG1 in lung adenocarcinoma; B.negative expression of E-cadherin in lung adenocarcinoma; C.positive expression of vimentin in lung adenocarcinoma; D.negative expression of PTTG1 in lung adenocarcinoma; E.positive expression of E-cadherin in lung adenocarcinoma; F.negative expression of vimentin in lung adenocarcinoma; G.positive expression of PTTG1 in lung squamous cell carcinoma; H.negative expression of E-cadherin in lung squamous cell carcinoma; I.positive expression of vimentin in lung squamous cell carcinoma

图1免疫组织化学方法检测非小细胞肺癌组织中PTTG1,E-cadherin及vimentin的表达
Fig1ExpressionofPTTG1,E-cadherinandvimentininNSCLCtissuebyimmunohistochemicalstaining(×100)

A.expression of PTTG1 in NSCLC patients; B.expression of PTTG1 in NSCLC cell lines图2 PTTG1在NSCLC患者及细胞系中的表达Fig 2 Expression of PTTG1 in NSCLC patients andNSCLC cell lines

2.3已转染NSCLC细胞系中PTTG1、E-cadherin、vimentin蛋白的表达

Western blot结果显示，PTTG1蛋白的表达量在SiPTTG1/H1299细胞中较Scr/H1299细胞中明显减少，而在A549/PTTG1细胞中较A549/con细胞中明显增多，提示细胞转染成功。Vimentin蛋白在SiPTTG1/H1299细胞(0.26±0.09)中的表达量较Scr/H1299细胞(1.29±0.14)中明显减少(Plt;0.001)，而在A549/PTTG1细胞(0.84±0.08)中表达量比A549/con细胞(0.16±0.09)明显增多(Plt;0.001)。E-cadherin蛋白在SiPTTG1/H1299细胞(0.86±0.09)中的表达量较Scr/H1299细胞(0.17±0.07)中明显增多(Plt;0.001)，而在A549/PTTG1细胞(0.46±0.11)中表达量比A549/con细胞(0.94±0.09)中明显减少(Plt;0.001)(图3)。结果表明PTTG1可以明显促进NSCLC细胞的EMT发生。

图3 Western blot检测PTTG1, E-cadherin及vimentin在转染细胞中的表达Fig 3 Expression of PTTG1, E-cadherin and vimentinin transfected cells by Western blot

2.4 已转染NSCLC细胞系的形态学观察

光学显微镜下观察各组细胞的形态学变化(图4)，结果发现A549/PTTG1细胞与A549/con细胞相比，细胞变得细长伪足不同程度的增多；而SiPTTG1/H1299细胞与Scr/H1299细胞相比，细胞伪足减少。

图4 各种细胞的形态学改变Fig 4 Morphological change of A549/PTTG1, A549/con,SiPTTG1/H1299 and Scr/H1299 cells(×200)

3 讨论

PTTG1是一种肿瘤转化基因，在没有任何辅助基因的参与下就能引起细胞的转化，其与许多肿瘤的发生存在密切的关系[4]。PTTG1已经被认定为癌基因。PTTG1的过度表达可以促进细胞的增殖和促进裸鼠的肿瘤生成[5]。PTTG1的表达水平与肿瘤生成、血管生成和转移都有密切的关系[6- 7]。PTTG1可以通过调节Twist、Snail、Slug和E-cadherin从而促进卵巢癌EMT的发生[8]。本研究先前结果表明PTTG1可以通过cofilin/LIMK的磷酸化促进NSCLC细胞的F- actin的聚合和通过PI3K/Akt/MMP途径促进NSCLC的侵袭和转移[2]。本实验应用免疫组织化学的方法检测了NSCLC组织中PTTG1、E-cadherin和vimentin的表达，结果显示PTTG1与E-cadherin的表达呈负相关，而与vimentin的表达呈正相关。

许多研究表明，在胚胎发育过程中，参与EMT的基因同时也可以控制细胞的转移过程，EMT是多种肿瘤发生转移的一个很重要的原因[9]。E-cadherin在多种肿瘤组织如肺癌、结肠癌等表达下调，其表达下调与肿瘤的复发和转移密切相关[10]。肿瘤细胞发生EMT的重要标志是E-cadherin表达下调。Vimentin在正常的上皮细胞中没有表达，是间叶细胞的标志物[11]。EMT的另一个重要标志是上皮细胞表达vimentin[12]。本实验应用两种NSCLC细胞系从正反两个方面检测了PTTG1在NSCLC EMT中的作用，结果显示PTTG1可以促进低侵袭性细胞系A549发生EMT从而促进A549的侵袭和转移，而敲除高侵袭性细胞系H1299中的PTTG1可以反转EMT的发生从而阻止H1299细胞的侵袭和转移。

综上所述，PTTG1能促进NSCLC EMT的发生，从而促进NSCLC的浸润和转移。此实验结果表明，PTTG1的抑制可以作为反转EMT的新靶点从而抑制NSCLC的浸润和转移，为提高NSCLC患者的生存率提供实验和理论依据。

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PTTG1 induces migration and invasion ofnon-small cell lung cancer through epithelial-mesenchymal transition

LI Hong-li1, YIN Chong-gao2*

(1.Medicine Research Center; 2.College of Nursing, Weifang Medical University，Weifang 261053, China)

ObjectiveTo investigate the role of PTTG1 in the migration and invasion of Non-small cell lung cancer.MethodsTo detect the expression of PTTG1, E-cadherin and Vimentin in 80 cases of NSCLC using immunohistochemistry. Cells were divided into four groups: 1)A549/con, cells were transfected by empty vector; 2)A549/PTTG1, cells were transfected by purpose gene; 3)Scr/H1299, cells were transfected by empty vector; 4)SiPTTG1/H1299, cells were knocked down purpose gene. Western blot was used to analyze the expression of PTTG1, E-cadherin and Vimentin.ResultsThe protein expression of PTTG1 in NSCLC was negatively correlated with E-cadherin and positively correlated with Vimentin (Plt;0.05). H1299 cells expressed higher PTTG1, and A549 cells expressed lower PTTG1. The expressions of PTTG1 and Vimentin were lower in SiPTTG1/H1299 cells than those in Scr/H1299 and H1299 cells after trancfected 24 hours, but the E-cadherin expression was higher. At the same time, the protein expression of Vimentin was up-regulated and the expression of E-cadherin was down-regulated in A549/PTTG1 cells.ConclusionsPTTG1 promotes migration and invasion of NSCLC through EMT.

PTTG1; EMT; Lung tumor; migration

2014- 02- 27

2014- 04- 23

山东省中青年科学家科研基金(BS2011YY060)；山东省高等学校科技计划(J10LF64，J12LK03，J13LK03)

*通信作者(correspondingauthor)：ycg0711@sina.com

1001-6325(2014)10-1376-05

R 737.9；R 73- 37

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