黑桫椤叶中总黄酮含量的测定

赵则海

（肇庆学院 生命科学学院，广东 肇庆 526061）

黑桫椤(Alsophila podophylla Hook.)属桫椤科(Cyatheaceae)桫椤属(Alsophila)黑桫椤亚属(Subgenus Gymnosphaera)[1]，是孑遗植物中濒危蕨类植物的代表之一[2].桫椤植物含有黄酮类、甾体及三萜类、生物碱、酚类、蛋白质类等多种活性物质[3]，对许多疾病具有明显的疗效[4].近年来，有学者采用大孔树脂吸附法研究了桫椤（Alsophila spinulosa(Hook.)Tryon）叶总黄酮提取纯化工艺[5]，而涉及黑桫椤叶总黄酮测定的研究尚未见报道.本实验采用分光光度法对黑桫椤叶总黄酮含量进行了测定，并对沟底和山坡采样样品中的总黄酮含量进行了比较.

1 仪器与试剂

本实验所用仪器如下：722型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；SK8200H型超声波清洗器（频率59 kHz，功率500 W），上海科导超声仪器有限公司；AE240S型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司.本实验所用试剂如下：芦丁对照品由中国药品生物制品检定所提供，氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、甲醇、乙醇、丙酮等试剂均为分析纯.

2 材料与方法

2.1 实验材料

在广东省肇庆鼎湖山和九龙湖，分别从沟底和山坡按生长条件采集样品；黑桫椤叶复叶按嫩叶、成熟叶、老叶采集；每个复叶按叶片和复叶柄分别烘干粉碎备用.

2.2 对照品溶液的制备

在105 ℃的温度下烘干芦丁对照品至恒重，精确称取芦丁对照品4.82 mg置于10 mL容量瓶中，用乙醇定容，作为标准品溶液，质量浓度为0.482 g/L.

2.3 供试样品溶液制备

将干燥的黑桫椤粉末用孔径0.2 mm的筛子过滤，精密称取约0.1 g置于10 mL容量瓶中，加入体积分数为60%的乙醇，超声提取1 h，定容至10 mL，作为供试品溶液[6].

2.4 标准曲线建立

精确吸取对照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL 分别置于10 mL 容量瓶中，加蒸馏水至2 mL；加质量分数为5%的亚硝酸钠试液0.4 mL，放置6 min；加质量分数为10%的硝酸铝试液0.4 mL，放置6 min；加质量分数为5%的氢氧化钠试液4 mL，加水定容，摇匀，放置15 min；于510 nm处测定吸光度.以浓度（C）与吸光度（A）进行直线回归，得回归方程为C=10.147A+0.009 5，R2=0.999 1.

2.5 样品的测定

吸取供试样品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，按标准曲线步骤操作，于510 nm处测定吸光度，计算其总黄酮的质量分数：总黄酮的质量分数=(浓度×定容体积/样品量)×100.

3 测定结果

3.1 黑桫椤叶片总黄酮的提取条件

1）超声提取时间.以体积分数为60%的乙醇为提取剂，在超声功率不变的条件下，随着超声时间的增加，黑桫椤叶片中总黄酮含量升高，见图1.超声提取60 min后，总黄酮含量增长缓慢，由此将超声提取60 min作为提取条件.

2）不同浓度提取剂对总黄酮含量的影响.黄酮类化合物易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醚等有机溶剂中，其中乙醇和甲醇是常用的提取溶剂[7].用不同浓度的乙醇、甲醇、丙酮提取剂对黑桫椤叶片中总黄酮进行1 h超声提取，其中体积分数为60%的乙醇和甲醇的提取效果较好，见图2.高浓度的乙醇、甲醇及丙酮提取液颜色呈绿色或墨绿色，受叶绿素的影响较大.体积分数为60%的乙醇黑桫椤提取液呈现淡黄色或淡绿色，具有很好的透光性.

图1 超声提取时间对黑桫椤叶片总黄酮含量的影响

图2 不同浓度提取剂对黑桫椤叶片中总黄酮提取效果的影响

3）料液比对黑桫椤总黄酮提取效果的影响.黑桫椤叶片总黄酮的提取随着提取溶剂量的增加而增加.由图3可见，料液比在1:50～1:100之间增幅较小.溶剂用量少时，提取不完全，用量过多则会造成浪费，所以黑桫椤叶片总黄酮提取的最佳料液比为1:50.

3.2 黑桫椤叶中不同部位总黄酮含量比较

山坡上采集的黑桫椤叶总黄酮的质量分数平均为4.625%，叶片平均为5.672%，复叶柄平均为3.577%；沟底采集的黑桫椤叶总黄酮的质量分数平均为3.303%，叶片平均为3.582%，复叶柄平均为3.025%（见表1）.黑桫椤叶片总黄酮的质量分数为嫩叶>成熟叶>老叶；复叶柄总黄酮的质量分数为成熟叶>老叶>嫩叶.山坡上的黑桫椤叶总黄酮的质量分数高于沟底.

图3 不同料液比对黑桫椤叶片总黄酮提取效果的影响

表1 黑桫椤叶不同部位总黄酮的含量

4 讨论

黑桫椤是受国家重点保护的濒危植物，因而不能采集其茎和根.本实验以黑桫椤叶片为原料进行总黄酮测定.现有文献中未见有关黑桫椤总黄酮测定的报道，通过超声提取及分光光度法测定黑桫椤中总黄酮的含量，为黑桫椤的可持续开发利用提供了依据.甲醇和乙醇均可作为黑桫椤总黄酮的提取溶剂.体积分数为60%的乙醇是提取黑桫椤总黄酮安全、有效的溶剂.1:50的液料比，超声60 min，对黑桫椤总黄酮的提取效果较好.沟底生境较为适宜黑桫椤生长，而生长于山坡的黑桫椤叶中总黄酮含量升高，可能与其受到环境胁迫有关.黑桫椤叶中总黄酮含量较高（山坡和沟底总黄酮的质量分数分别为3.303%和4.625%），甚至老叶中总黄酮的质量分数也达到3.0%以上.研究黑桫椤黄酮类物质，对科学、合理地保护、利用黑桫椤资源具有重要意义.

[1]苏应娟,王艇,郑博,等.根据cpDNA trnL-F非编码区序列变异分析黑桫椤海南和广东种群的遗传结构与系统地理[J].生态学报,2004,24(5):914-919.

[2]张丽兵,张宪春.中国植物志:第6卷第3分册[M].北京:科学出版社,2000:265-267.

[3]陈封政,李书华,向清祥.濒危植物桫椤不同部位化学组分的比较研究[J].安徽农业科学,2006,34(15):3 710-3 711.

[4]戴锡玲,李新国,张莹.药用蕨类植物资源研究及其开发利用[J].资源开发与市场,2003,19(6):397-399.

[5]陈封政,李书华,向清祥.桫椤叶总黄酮正交提取工艺和大孔树脂吸附分离特性的研究[J].中成药,2008,30(11):1 600-1 604.

[6]曹建国,赵则海,李庆勇,等.刺五加丁香苷和总黄酮含量及其季节动态[J].植物学通报,2006,23(3):269-274.

[7]赵兵,王玉春,欧阳藩,等.超声波在植物提取中的应用[J].中草药,1999,30(9):1-3.