HPLC-ELSD测定人参归脾丸中黄芪甲苷的含量

李晓达，郭伟英

(辽宁医学院药学院，辽宁 锦州 121001)

人参归脾丸是由人参80 g、白术(麸炒)160 g、茯苓160 g、甘草(蜜炙)40 g、黄芪(蜜炙)80 g、当归160 g、木香40 g、远志(去甘草炙)160 g、龙眼肉160 g、酸枣仁(炒)80 g 10 味中药组成［1］，用于益气补血，健脾养心 用于心脾两虚，气血不足所致的心悸，怔忡，失眠健忘，食少体倦，面色萎黄以及脾不统血所致的便血崩漏带下诸症。炙黄芪协助人参有益气补脾的功效。黄芪甲苷是黄芪中的重要成分，通过测定黄芪甲苷的含量来达到对人参归脾丸的质量控制。因此本文测定了人参归脾丸中黄芪甲苷的含量。为人参归脾丸的质量控制提供更全面有效的方法。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪(日本日立公司)，L-2130四元梯度泵，D-2000 Elite 色谱工作站，蒸发光散射检测器(ELSD)(美国奥泰公司)。乙腈、甲醇和甲酸均为色谱纯，重蒸水为自制。黄芪甲苷对照品 (上海源叶生物科技有限公司，批号:20120501，纯度＞98.0%)。3 批市售人参归脾丸(购自锦州药店，规格9 g 丸批号:0010267，2013188，3010441);10 味单味药材(购自锦州药店)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱 色谱柱Agilent TC C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱温25 ℃，流动相:甲醇-水 (75∶25)，流速1.0 mL·min-1;ELSD 参数:漂移管温度90 ℃，载气流量1.6 L·min-1，载气为空气;分离度均＞1.5;理论板数按黄芪甲苷计算不低于3 000;进样量10 μL。在上述色谱条件下各成分色谱峰峰型对称，黄芪甲苷与其他峰能够基线分离。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的黄芪甲苷对照品0.32 mg，置于1 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，备用。

2.2.2 样品溶液的制备 取本品18 g，加入甲醇100 mL 超声提取2 次，每次30 min，合并提取液，减压浓缩至干，加水10 mL 超声溶解，用水饱和的正丁醇萃取3 次，合并正丁醇层，减压浓缩至干，加10 mL 甲醇溶解，过0.45 μm 滤膜，备用。

2.2.3 阴性样品制备 按处方比例及工艺，制备不含黄芪的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制备成阴性样品溶液，备用。

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线的制备 分别精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇配制成浓度分别为600、450、300、150、75、37.5 μg·mL-1的系列溶液，按上述色谱条件分别进样测定。以溶液浓度的自然对数(X)为横坐标，峰面积积分值的自然对数(Y)为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y=0.942 1X +6.263 4 (r=0.999 8)。结果表明黄芪甲苷的含量在37.5～600 μg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.3.2 精密度考察 精密吸取同一对照品溶液，按上述色谱条件重复进样6 次，每次10 μL，测定黄芪甲苷峰面积积分值。结果显示保留时间稳定，峰面积的RSD=0.76% (n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性考察 取同一批号人参归脾丸6 份，在上述色谱条件下测定，计算黄芪甲苷含量的RSD 为0.61%，结果表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性考察 精密吸取同一对照品溶液，室温下放置，于0，2，4，6，8，12 h 按上述色谱条件进样分析。测得黄芪甲苷峰面积的RSD 为1.1%。结果表明黄芪甲苷在12 h 内稳定。

2.3.5 加样回收率 精密称取已知含量的人参归脾丸1 g，分别定量加入黄芪甲苷对照品，按上述色谱条件测定，计算加样回收率。结果:见表1，平均回收率为98.8%，RSD=3.4%。

2.4 样品含量测定 取不同批号的样品，按上述色谱条件测定。结果见表2。样品和标准品的高效液相色谱图见图1。

表1 人参归脾丸回收率实验

表2 人参归脾丸中黄芪甲苷测定结果

3 讨 论

人参归脾丸是较为常用的中成药，在部颁标准中只有显微鉴别和当归的薄层鉴别。缪金财［2］利用薄层色谱法对人参归脾丸中的人参和白术进行了定性鉴别。林德平［3］等对人参归脾丸中的黄芪、甘草、酸枣仁、木香分别薄层定性分析。尚春英［4］等通过薄层色谱法对人参归脾丸中的白术、甘草进行了鉴别。在对人参归脾丸的研究中缺乏对指标成分的定量分析，这对药品的质量控制带来了很大的不便。

对于检测器的选择，黄芪甲苷为黄芪中的主要成分，但黄芪甲苷在紫外检测器上只有末端有吸收，噪音大，灵敏度降低，因此对于黄芪甲苷的含量测定多采用蒸发光散射检测器［5-7］。蒸发光散射检测器为通用型质量检测器，检测时流动相在检测器内挥发成气体，样品组分形成气溶胶，进入检测室产生响应，响应大小由被分析物质的颗粒的数量和大小决定，从而获得理想的基线和检测的灵敏度，克服了紫外末端检测的不足［8］。

由于所研究的中成药中有10 味中药，成分复杂，在流动相选择和提取工艺方面都进行了详细的考察。对于流动相的选择，选取乙腈、水和甲醇水比例分别为(10∶90、20∶80、32∶68、50∶50、75∶25)结果以75∶25 分离效果好，黄芪甲苷能与其他成分达到基线分离，由于乙腈价格较贵和毒性较大，确定甲醇水为流动相。对于提取方法的选择，我们考察了甲醇提取直接检测和用正丁醇萃取后再检测，前者无法检测到黄芪甲苷，后者黄芪甲苷与其他成分分离效果较好。

本实验研究的方法能够快速，方便，准确的检测人参归脾丸中黄芪甲苷的含量，为人参归脾丸的质量控制提供参考。

图1 人参归脾丸样品高效液相色谱图

［1］卫生部颁药品标准.中药成方制剂［S］.第4 册.1991:6.

［2］缪金财，刘峰，宋刚.人参归脾丸主要成分的鉴别［J］.中国药业，2008，17 (16):40.

［3］林德平，曲永梅，李亚荣.人参归脾丸的薄层色谱鉴别［J］.中国中医药杂志，2008，6 (5):24-26.

［4］尚春英，段佳蔽，胡齐莉.人参归脾丸的质量标准研究［J］.黑龙江医药，2006，19 (4):253-254.

［5］董焱，何英翠，沈文娟，等.盆炎净颗粒中黄芪甲苷HPLC-ELSD 含量测定方法的建立［J］.中南药学，2013，11(1):55-57.

［6］景鹏，梁晓，高亚妮，等.益髓颗粒中黄芪甲苷的含量测定研究［J］.陕西中医，2014，35 (2):230-231.

［7］刘浩文，刘嘉仪，杨妙荣，等.黄芪药材中黄芪甲苷含量测定的两种方法的比较研究［J］.中药新药与临床药理，2011，22 (6):659-662.

［8］李存金，郭飞宇.HPLC-ELSD 测定复方益母草胶囊中盐酸水苏碱的含量［J］.中国现代应用药学，2013，30 (1):72-74.