棘豆狼毒水煎液对小鼠组织中一氧化氮含量的影响

张 寿，莫重辉，常 兰，吴启之

（青海大学农牧学院动物医学系，青海 西宁 810016）

棘豆为多年生草本，植株有黏性，茎极短。羽状复叶，长7～15 cm。生于山坡草地、沙土和河滩上，分布于甘肃、青海、新疆、四川等地。棘豆具有重要的经济和生态价值，是重要的牧草资源，其中部分物种对牲畜是有毒植物。国际上将黄芪属和棘豆属中含苦马豆素的有毒植物称疯草。棘豆中所含的苦马豆素是疯草植物的主要有毒成分[1]。它可以引起牲畜神经紊乱、生殖障碍、体格消瘦和食用成瘾等方面的慢性中毒,即疯草病。一般在牲畜采食疯草一段时间后才表现出中毒症状。

狼毒为瑞香科多年草本植物，多年生草本，高20～50 cm，生于海拔2 600～4 200 m的干燥而向阳的高山草坡、草坪或河滩台地。瑞香科植物在世界上约有50属500余种,主要分布于热带和温带地区,尤以亚洲最多,我国有9属90余种，主要分布于长江以南各地[2]。狼毒花根系大，吸水能力强，能够适应干旱寒冷的气候，生命力强，周围草本植物很难与之抗争，在一些地方已被视为草原荒漠化的“警示灯”。而在高原上狼毒的泛滥，最重要的原因则是人们放牧过度，其他物种少了，狼毒乘虚而入。因狼毒有毒，而且其春季返青早，生长快，春季家畜对草选择性差、贪青或处于饥饿状态而误食，发生狼毒中毒，如不及时救治则会死亡，其中毒多为急性中毒，主要症状为呕吐、腹痛、腹泻、四肢无力、卧地不起、全身痉挛、头向后弯、心悸亢进、粪便带血,严重时虚脱或惊厥死亡，母畜可导致流产等[3]。

狼毒、棘豆是青海省的主要毒害草之一，同样为青海省的畜牧业发展带来了一定的危害，本试验进行棘豆、狼毒对小鼠组织中的NO含量的研究，为今后棘豆、狼毒的有效开发利用和中毒病的防治提供一定的理论和参考依据。

1 材料

1.1 棘豆、狼毒水煎液的制备 由青海大学农牧学院动物医学系实验室自制，称取采集阴干的棘豆、狼毒草各10 g，加水煮沸30 min后过滤，然后将过滤出的药液分别浓缩至1 000 mL（青绿色液体带有中草药的气味），保存备用。

1.2 供试动物 健康小鼠60只，体重18～22 g，由青海省地方病研究所实验动物中心提供，常规饲养7 d，观察，取无异常者备用。

1.3 主要试剂 一氧化氮（NO）测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

1.4 主要设备 FSH-2A可调高速匀浆机（常州市普达教学仪器有限公司）；TD25-WS多管架自动平衡离心机（长沙湘仪离心机有限公司）；HH-60数显恒温搅拌循环水箱（常州市普达教学仪器有限公司）；UV-1600紫外可见光分光光度计（上海美谱仪器有限公司）。以上仪器均由本系基础兽医学实验室提供。

2 方法

2.1 动物分组及处理 选取60只健康小鼠，适应性饲养7 d后将雌雄分开并随机分成棘豆组、狼毒组和对照组。对照组每天灌服生理盐水0.25 mL/只，棘豆组每天灌服自制棘豆水煎液0.25 mL/只，狼毒组每天灌服自制狼毒水煎液0.25 mL/只，连续灌服40 d，并在每天灌服前称重记录，各组小鼠自由摄食，自由饮水。末次灌胃24 h后迅速将小鼠处死，同时剖检并取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏，备用。

2.2 临床症状观察 每天观察并记录各试验组小鼠的饮食状况，精神状况，行为活动及临床症状等变化，并每天测量各试验组小鼠的体质量。

2.3 组织匀浆的制备 每个组织块取2 g左右，放在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液并用滤纸拭干；称重，放入5～10 mL的小烧杯中；用量筒量取9倍于组织块的预冷匀浆介质（0.86%NaCl溶液），用移液管将其总量的2/3移至小烧杯中；用眼科剪剪碎，将剪碎的组织块倒入玻璃匀浆杯中，再用剩余的1/3匀浆介质冲洗残留于烧杯壁的组织碎块，一起倒入匀浆杯中用匀浆机进行匀浆（用10 000～15 000 r/min左右研磨，匀浆时间10 s，间隙30 s/次，连续3～5次，在冰水中进行）制成10%组织匀浆，将制备好的匀浆用普通离心机3 500 r/min离心15 min，取上清液，备用。

2.4 NO含量的测定 严格按照NO测定试剂盒的说明书进行测定。

2.5 统计分析 采用SPSS17.0软件包进行差异显著性检验。各指标均用平均数±标准差表示，对所有数据进行t检验，P＜0.05为差异性显著。

3 结果与分析

3.1 棘豆对小鼠各组织中NO含量的影响（见表1）。

表1 棘豆对小鼠各组织中NO含量的影响 μg/mL

由表1可知，与对照组相比，棘豆组小鼠脾脏中的NO含量均显著降低（P＜0.05），其他组织中NO含量差异不显著。

3.2 狼毒对小鼠各组织中NO含量的影响 见表2。

表2 狼毒对小白鼠各组织中NO含量的影响 μg/mL

由表2可知，与对照组相比，狼毒组小鼠心脏、脾脏中的NO含量均显著降低（P＜0.05），其他组织中NO含量差异不显著。

4 讨论

近年来的研究表明，棘豆中所含的苦马豆素生物碱，是疯草植物的主要有毒成分。国内外研究认为，苦马豆素引起家畜中毒的机理为苦马豆素是甘露糖苷酶的特异性抑制剂,可导致低聚糖在溶酶体内蓄积，从而影响糖蛋白的合成,其特征性病理变化为组织细胞的胞浆空泡变性，从而能使动物中枢神经系统受到损害。狼毒提取物对肿瘤细胞有较强的抑制作用，此外还有抗菌、抗病毒与抗氧化等作用，是一个理想的天然药物开发品种[4]。狼毒中所含的二萜类化合物具有抗癌活性和提高机体免疫功能[5]。

一氧化氮是体内非特异性防御反应系统的组成部分。体内的巨噬细胞嗜中性粒细胞等在细胞因子和细菌性内毒素脂多糖刺激下可以激活一氧化氮合酶合成大量的一氧化氮。一氧化氮对细菌、真菌、寄生虫、瘤细胞有杀伤作用,对体内的肿瘤细胞有毒性作用,但在其发挥免疫作用的同时,对那些表达一氧化氮合酶的细胞自身及其附近细胞也有毒性作用[6]。一氧化氮还可以通过与其他各种细胞因子复杂的相互作用，增强机体的非特异性免疫功能，抑制特异性免疫反应[7]。NO是一种难溶于水的脂溶性气体,也是一种自由基,它在体内广泛参与调节神经系统、心血管系统的功能和介导免疫应答等诸多病理和生理过程,其产生异常与临床多种疾病的发生发展有密切关系,同时影响着衰老的进程。正常情况下,神经元合成并释放适量NO，并不产生毒性。如果神经元释放过量NO，就会产生细胞毒性作用致使神经细胞死亡，从而引起脑功能的衰退。NOS存在于体内许多脏器细胞,在体内有多种异构体。NOS可催化L-精氨酸形成NO，是NO产生的关键酶，随着年龄增长,各种类型NOS表达水平会发生相应变化,从而改变了细胞内NO水平。当NOS活性升高,细胞中NO也相应增多,因此在NOS活性较高的老年动物中,组织细胞中NO的含量也较多[8]。孔德娟等曾发现自然衰老大鼠与D-半乳糖催老小鼠血浆中的NO和NOS均有所增加[9]。D-半乳糖衰老模型是目前较常用的一种人工催老模型,具有衰老变化明显,模型稳定的特点,其原理是使机体产生大量自由基,降低机体抗氧化能力,而脂质水平增加而引起亚急性衰老,其表现为多种抗氧化酶活性下降[10]。

本次试验结果表明，棘豆与对照组相比，棘豆组小鼠脾脏中NO的含量显著降低（P＜0.05），其他组织中NO含量都有降低，但差异不显著；狼毒组小鼠心脏、脾脏中的NO含量均显著降低（P＜0.05），其他组织中NO含量都有降低，但差异不显著。说明试验剂量的狼毒、棘豆能降低小鼠组织中NO的含量，但临床上没出现明显的中毒症状和死亡。由于本次试验对狼毒、棘豆的剂量方面未做进一步研究，究竟小鼠对狼毒、棘豆的耐受性有多大？家畜（牛、羊等）对狼毒、棘豆的适应量是多少？狼毒、棘豆能否作为家畜日常饲料？这些问题有待于以后的研究中探讨。

[1]高新磊，韩冰，赵萌莉，等.疯草及毒性成分研究进展[J].草业学报，2011，20（3）:279-286.

[2]侯宽昭.中国种子植物科属词典(修订版)[M].北京：科学出版社，1982:4-5.

[3]黄祖杰，周淑清.草地重要有毒植物-狼毒[J].四川草原，1993（4）:24-27.

[4]王敏，贾正平，马骏，等.瑞香狼毒总黄酮提取物的抗肿瘤作用[J].中国中药杂志，2005，30（8）:603-605.

[5]刘文粢.狼毒大戟萜类和蒽类化合物的分离鉴定[J].中药材，1992，20（7）:351-353.

[6]刘耕陶.一氧化氮的研究前景[J].中华医学杂志，1996，76（8）:563-564.

[7]白杰，李彦东.一氧化氮生物学特性研究进展[J].中国商界，2009，5（174）:154-155.

[8]王怀颖，张秋燕，肖锋，等.一氧化氮与衰老的研究[J].医学综述，2005，11（4）:302-305.

[9]孔德娟，陈永春，李恩，等.老年大鼠体内NO、NOS、AGEs和SOD水平与衰老的关系[J].中国老年学杂志，1999，19(3):175-176.

[10]崔旭，李文彬，张炳烈，等.D-半乳糖对神经元和成纤维拟老化作用的实验研究[J].中国应用生理学杂志，1997，13（2）:131-133.