利用 SRAP分子标记研究河川沙塘鳢群体的遗传多样性

侯新远等

摘要：利用相关序列扩增多态性SRAP分子标记对 3个河川沙塘鳢（Odontobutis potamophila）自然群体[安徽省当涂（DT）群体、浙江省余姚 （YY）群体、江苏省太湖东西山（DXS）群体]进行了遗传多样性分析。从196对引物组合中筛选出 11 对扩增条带清晰、稳定的引物组合对3个群体进行扩增，共获得71个位点；3个群体内多态位点占比为690%～24.14%，其中DT群体多态位点占比为6.90%，YY群体多态位点占比为24.14%、DXS群体多态位点占比为24.14%；群体的Neis 基因多样性指数（H）为0.033 0～0.093 9[DT（0033 0）

关键词：河川沙塘鳢；相关序列扩增多态性；遗传多样性；多样性指数

中图分类号： S917文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0037-03

收稿日期：2014-01-20

基金资助：国家星火计划（编号：2013GA690166）；江苏省科技支撑计划（农业）项目（编号：BE2013441）；“江苏省六大人才高峰”高层次人才项目（编号：NY-032）；江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（11）1037]；南京师范大学科技成果转化基金（编号：2013-02）；江苏省扬州市农业科技攻关计划（编号：2012074）；。

作者简介：侯新远 （1988—），女，山西阳泉人，硕士研究生，从事鱼类种质资源与遗传育种研究。E-mail：houxinyuan1988@126.com。

通信作者：尹绍武，博士，教授，博士生导师，主要从事鱼类种质资源与遗传育种研究。E-mail：yinshaowu@163.com。河川沙塘鳢（Odontobutis potamophila）属鲈形目（Perciformes）虾虎鱼亚目（Gobioidei）沙塘鳢科（Odontobutidae）沙塘鳢属（Odontobutis），广泛分布在我国长江中下游（湖北荆州至上海江段 ）及其沿江各支流、钱塘江水系、闽江水系，为我国小型淡水底栖肉食性鱼类[1-2]。河川沙塘鳢营养价值高，深受人们喜爱，是一种很有开发前景的小型经济鱼类。在2012年世界自然保护联盟（IUCN）红色名录中，河川沙塘鳢被评级为信息缺乏物种。近年来，由于过度捕捞、环境破坏及人类其他活动，导致其自然资源受到极大的破坏，从而对其种群遗传结构产生一定影响。国内外关于河川沙塘鳢的报道多集中在其人工繁殖、生物学特性、病害防治等方面[3-13]，关于其种质资源利用和资源保护等方面的报道较少，仅有Hou等采用线粒体DNA（D-loop）序列对河川沙塘鳢的群体进行遗传多样性研究[14]，李妍等采用ISSR分子标记对江苏常熟河川沙塘鳢个体大小不一的2个群体遗传差异性进行研究[15]。相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是一种新型的旨在扩增开放阅读框（ORFs）的分子标记技术[16]，该分子标记具有简单、高效、稳定、重复性高、产率高和多态性较丰富等特点，目前广泛应用于植物种质鉴定、基因定位、遗传多样性分析和图谱构建[17-20]。目前在水产研究中已用于罗氏沼虾[21]、海南沼虾[22]、草鱼[23]、暗纹东方鲀[24]、团头鲂[25]、彩鲤[26]、乌苏里拟鲿[27]、文蛤[28]的遗传多样性研究。本研究采用SRAP分子标记对3个群体的河川沙塘鳢遗传多样性进行分析，以期了解河川沙塘鳢种质资源现状及其种群间的遗传分化情况，为河川沙塘鳢种质资源保护和开发利用提供参考资料。

1材料与方法

1.1试验材料

试验所用样品分别采自安徽省当涂县运粮河流域（简称DT，31°25′37″N，118°42′59″E）、浙江省余姚市姚江流域（简称YY，30°0′16.49″N，121°3′6.33″31°25′37″E）、江苏省太湖靠近东西山侧水域（简称DXS，30°59′58.16″N，120°27′21.02″E），每个种群采集8尾，将尾鳍保存于无水乙醇中（-20 ℃）备用。

1.2基因组DNA提取

采用常规苯酚-氯仿抽提法[29]从鳍条组织中提取基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，放入 -20 ℃ 冰箱储存备用。

1.3SRAP-PCR 反应

根据已发表的SRAP通用引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成正、反向引物各14个（表1），将它们随机配对构成196对不同引物组合，用于PCR扩增，筛选出带型清晰、稳定、多态性较好的引物组合用于进一步试验。25 μL SRAP-PCR反应体系为：10×buffer 2.5 μL（含 Mg2+），2 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 mmol/L正/反向引物各 0.5 μL，5 U/μL Taq DNA 酶0.2 μL，基因组 DNA 1 μL，不足部分用灭菌双蒸水补齐。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性 1 min，35 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸2 min，5个循环；94 ℃ 变性 1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。

表1用于河川沙塘鳢遗传多样性分析的SRAP引物序列

引物

1.4数据分析

根据SRAP扩增电泳图谱，将每条带视为1个位点，对每个样品SRAP扩增带的有无进行统计，有带记为1，无带记0，将电泳图谱转换成数字矩阵。采用POPGENE 1.32计算群体的Shannons信息指数（I）、Neis基因多样性（H），统计不同引物组合对不同群体的多态位点百分率（P），计算Neis无偏遗传距离（D）和遗传相似度（S），并根据遗传距离构建3个群体的UPGMA聚类图。

2结果与分析

2.1SRAP引物的筛选及扩增图谱

利用河川沙塘鳢3个群体的DNA对196对SRAP引物组合进行筛选，其中11个引物组合（F2R3、F2R8、F2R12、F3R3、 F3R5、F3R10、 F4R4、F6R9、F9R11、F11R12、F12R8）得到稳定、可重复、多态性好的扩增图谱（图1、图2、表2）。

表2河川沙塘鳢不同SRAP引物组合的多态性位点数

引物组合位点总数

（个）引物组合位点总数

（个）F2R311F4R46F2R86F6R95F2R126 F9R115F3R37F11R126F3R54F12R88F3R107

记录扩增出的在100～750 bp之间的条带数（即位点数），发现每对引物组合扩增的位点数为 4～11 个。扩增位点最多的引物组合是 F2R3，扩增位点数为 11个；扩增位点最少的引物组合是F3R5，扩增位点数为 4个。

2.2群体遗传多样性分析

表2中11对引物组合在 24尾河川沙塘鳢个体中共扩增出71个位点，由表3对各群体遗传参数的比较发现：YY群体和DXS群体多态位点占比最大，为24.14%；DT群体最小，为6.90%。此外还可看出，Neis 基因多样性（H）由大到小依次为DXS群体（0.093 9）、YY群体（0.078 4）、DT群体（0.033 0）；Shannons 多样性指数（I）由大到小依次为DXS群体（0136 8）、YY群体（0.120 6）、DT群体（0.046 3）。整体结果可以看出，DXS群体、YY群体的多态位点占比、Neis 基因多样性和 Shannons 多样性指数均稍高于DT群体。

2.3群体遗传距离和遗传相似度

依据Nei的方法由各位点等位基因频率计算河川沙塘鳢3个群体间的Neis无偏遗传距离（D）、遗传相似度（S），结果

表3河川沙塘鳢3个群体SRAP扩增位点的多态性和遗传多样性参数

群体多态位点

占比（%）Neis基因

多样性（H）Shannons

信息指数（I）DT6.900.033 00.046 3YY24.140.078 40.120 6DXS24.140.093 90.136 8

见表4。可以看出，DT群体与YY群体间的遗传距离最大（0286 7），遗传相似度最小（0.750 7）；DXS 群体与YY群体的遗传距离最小（0.036 3），遗传相似度最大（0.964 4）。UPGMA 聚类图显示，YY群体和DXS群体聚为1支，DT群体单独聚为1支（图3）。

表4河川沙塘鳢群体间的Neis无偏遗传距离D

（对角线下方）和遗传相似度S（对角线上方）

群体DTYYDXSDT0.750 70.765 7YY0.286 70.964 4DXS0.267 00.036 3

3讨论与结论

遗传多样性作为生物多样性的重要组成部分，是物种多样性、生态系统多样性和景观多样性的基础，也是生命进化和适应的基础；种内遗传多样性越丰富，物种对环境变化的适应能力也越大。通常认为多态位点比率、Neis 基因多样指数和 Shannons 信息指数是衡量群体遗传多样性的常用指标。本研究中3个河川沙塘鳢群体的多态位点占比在6.90%～2414%间，Neis 基因多样指数为0.033 0～0.093 9，Shannons信息指数在0.046 3～0.136 8间。与其他水产动物的SRAP数据比较发现，3个群体的多态位点占比低于程长洪等研究的暗纹东方鲀群体（54.98%～58.87%）[24]，冉玮等研究的3个地理群体团头鲂（29.07%～58.14%）[25]，贾永义等研究的翘嘴红鲌群体（50.00%）、团头鲂群体（4632%）[30]，张志伟等研究的江苏南通文蛤（57.81%）[28]；周劲松等研究的罗氏沼虾（55.6%～64.1%）[21]；张慧研究的大麻哈鱼（7375%）[31]，可见河川沙塘鳢的遗传多样性目前仍处于比较低的水平，与Hou等用D-loop基因序列研究不同群体的河川沙塘鳢遗传多样性结果[14]一致。这可能与第四纪冰川有关，冰期使得很多淡水鱼都遭受了灾难性毁灭，河川沙塘鳢也难逃厄运，受到严重的破坏，只有少数幸存下来。除了历史原因，近年来环境恶化、生态栖息地被破坏、水利修建、人类过度滥捕等因素也导致河川沙塘鳢数量锐减。

遗传相似度和遗传距离从一定程度上衡定了种群间遗传差异程度[32]。本研究对各群体进行遗传结构分析结果表明，DT群体与YY群体间的遗传距离最大（0.286 7），遗传相似度最小（0.750 7），DXS 群体与YY群体的遗传距离最小（0036 3），遗传相似度最大（0.964 4），亲缘关系最近，同时UPGMA聚类图显示YY群体和DXS群体聚为1支，DT群体聚为单独的1支，与mtDNA控制区序列分析得出的DXS 群体与YY群体的遗传距离最小的结果一致[14]。从地理位置上看，DXS群体的地理位置与YY群体的地理位置较近，客观上增加了2个群体的遗传相似度。

本研究结果显示，河川沙塘鳢的遗传多样性低，为了恢复河川沙塘鳢渔业资源，在加强对其保护、保护其产卵场和改善水域环境条件的同时，应该严格设立禁捕期、限制捕捞器械规格，同时加强人们对渔业资源保护的意识，在明确遗传结构的基础上，加强河川沙塘鳢人工养殖的研究和推广，从而减轻人类对野生资源的捕捞压力，缓解市场需求。同时应选择等位基因数多、杂合度较高、亲缘关系接近天然个体的群体进行人工放流，从而恢复野生河川沙塘鳢资源。

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