过表达转OsILP基因水稻株系的构建

孙伟清++张昌轮++袁茜++梁建生++吕冰

摘要：采用RT-PCR和TA克隆技术，从水稻品种日本晴中扩增出类整合素候选基因（integrin-like protein，ILP）OsILP的cDNA片段。经测序鉴定，克隆获得的目的片段长为1 167 bp，包含完整的CDS，编码388个氨基酸，预测分子量43 ku。进而将该片段连接至表达载体pTCK303中，通过PCR鉴定与酶切验证，结果表明成功构建了pTCK303-OsILP过表达载体。并将表达载体质粒转化为农杆菌EHA105，再通过农杆菌介导将其导入水稻日本晴的愈伤中，经遗传转化，阳性鉴定，获得了过表达转OsILP基因水稻株系。

关键词：水稻；类整合素蛋白；过表达；转基因株系

中图分类号： Q785；S336文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0017-04

收稿日期：2013-11-11

基金项目：江苏省自然科学基金（编号：BK2009185）。

作者简介：孙伟清（1987—），男，山东临沂人，硕士，主要从事植物逆境生理研究。E-mail：qdswqlzc@163.com。

通信作者：吕冰，博士，副教授，主要从事植物生理生化与分子生物学研究。E-mail：lubing@yzu.edu.cn。水稻OsILP即Os03g0199100、LOC_Os03g10240，别称UPF0496 protein 1，是由1 167个核苷酸序列编码388个氨基酸组成的未知功能蛋白，预测分子量43 ku，属于DUF677家族（domain of unknown function 677）。DUFs为具有保守结构域。但在Pfam等蛋白家族数据库中信息较少、功能尚待明确的一系列蛋白家族[1]。其中，DUF677 （PF05055）家族是植物中存在的一个功能未知的蛋白家族。该家族中，除OsILP外，拟南芥AT14A也是其中之一。AT14A是一个与动物整合素蛋白具有部分相似序列和功能的膜蛋白[2-3]，被命名为类整合素蛋白（integrin like protein，ILP）。

整合素是动物细胞黏附分子的重要成员，属于一类跨膜蛋白的超家族，是由2个跨膜糖蛋白亚基（α亚基、β亚基）通过非共价键连接而成的异二聚体[4]。从结构上看，α亚基、β亚基都是由1个大的N-胞外结构域、1个短的跨膜结构域、1个短的C-胞内结构域组成[5]。构成胞外结构域的氨基酸通过折叠和缠绕形成一个结合 “口袋”，能识别并结合各种含有RGD（Arg-Gly-Asp）短肽序列的胞外基质分子，并调节其与配体结合的特异性。跨膜结构域相对较小，但在进化上属高度保守的区域。在胞质一侧，整合素直接与包括α-辅肌动蛋白在内的多种肌动蛋白结合蛋白相连[6]。当细胞外因素刺激或细胞本身的生理功能发生变化时，α-辅肌动蛋白可通过其酪氨酸磷酸化、结合Ca2+或其他信号分子而影响细胞骨架形态，调节细胞运动。整合素作为黏附受体的生物学功能是传导生化信号并改变细胞骨架的机械结构，从而构成了胞外基质（extracellular matrix，ECM）-质膜-细胞骨架连续体，成为动物细胞内外信号双向转导过程中的关键分子之一，在细胞的运动、增殖、分化、凋亡等方面起重要作用[7-9]。

序列比对结果表明，OsILP蛋白与拟南芥类整合素蛋白AT14A有22.87%的同源性，并且疏水氨基酸主要集中在 220～280 位氨基酸。预测蛋白结构（图1）显示，其与动物整合素亚基的构成更类似，即含有胞外结构域、跨膜结构域、胞内结构域各1个，且具有不同物种间较保守的同源序列，因此推测其为水稻中的类整合素（OsILP），参与了细胞内外信号转导过程的调控。

本研究采用分子生物学技术克隆出OsILP，并构建过表达载体，再通过农杆菌介导法转化水稻植株，获得过表达的转OsILP基因水稻株系，旨在为研究OsILP编码蛋白的表达、定位及生理功能，最终判断OsILP蛋白是否为水稻中的类整合素，以及研究其在细胞内外信号转导中的作用奠定基础。

1材料与方法

1.1供试材料

供试材料为粳稻品种日本晴（Oryza sativa subsp. japonica cv. Nipponbare）。克隆载体pMD19-T购自TaKaRa公司。pTCK303双元载体由中国科学院种康实验室惠赠。大肠杆菌（E.coli）DH5α、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105等分子生物学试验常用菌种由笔者所在实验室保存。

1.2OsILP基因扩增与T-A克隆

1.2.1引物设计根据GenBank公布的水稻基因及其登录号NM_001055818在NCBI 数据库中搜索OsILP基因的编码序列，并结合表达载体（pTCK303）的多克隆酶切位点[10]（图2）设计特异引物 （表1）。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，同时合成潮霉素（Hyg）抗性基因的引物。

1.2.2OsILP基因的PCR扩增提取日本晴水稻14 d幼苗的总RNA，以甲醛变性琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000 微量分光光度计检测RNA 质量，参照TaKaRa公司的cDNA第一链合成试剂盒说明书，采用20 μL反应体系反转录合成水稻cDNA第一链。

以第一链cDNA为模板进行PCR 扩增，扩增条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30次循环；72 ℃后延伸10 min。

1.2.3OsILP基因的T-A克隆与测序纯化的目的基因片段与pMD19-T载体连接，并转化大肠杆菌DH5α 感受态细

表1目标基因的PCR扩增产物

基因引物序列（5′→3′）产物大小（bp）OsILPF：GGATCCATGGGGAACAGCAGCA；R：ACTAGTTCAGCTAGGATGCCGGATGA1 167HygF：CTTCTGCGGGCGATTTGTG；R：TGACTGGAGCGAGGCGATG300

胞。对所获得的白斑菌落通过菌液PCR 扩增验证后，按照上海捷瑞生物工程有限公司质粒小提试剂盒说明书提取质粒，并送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序，以确定其是否为重组克隆载体pMD19-T-OsILP。

1.3过表达转OsILP基因载体的构建与农杆菌的获得

1.3.1OsILP基因过表达载体的构建将上述重组克隆载体（pMD19-T-OsILP）质粒和空载体pTCK303 质粒用限制性内切酶BamHⅠ和SpeⅠ 双酶切，分别回收目标区域（1 200 bp 左右）片段和空载体酶切产物（约14 kb） 片段，用T4-DNA 连接酶过夜连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

用2种方法分别验证重组质粒：一是进行菌落PCR验证；二是采用酶切验证。PCR产物和酶切产物均用琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.2过表达转OsILP基因农杆菌的获得采用冻融法将重组质粒转化到农杆菌EHA105感受态细胞中，对抗生素筛选出的阳性菌落以目的基因OsILP为目标产物进行PCR鉴定。

1.4过表达转OsILP基因水稻株系的获得与鉴定

水稻转基因操作步骤参考刘巧泉等的方法[11]，略作改动。提取T0代转化苗的叶片DNA，以潮霉素抗性基因为目标产物进行PCR扩增，扩增条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30次循环；72 ℃后延伸10 min。

2结果与分析

2.1OsILP基因的克隆

将从日本晴水稻中提取的总RNA反转录成cDNA第一链后，进行OsILP基因的PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的结果如图3-A所示，扩增产物大小为1 200 bp左右，符合目的片段1 167 bp预期。将回收并纯化后的目标片段进行T-A克隆，菌液PCR验证结果（图3-B）表明，目的片段已转入pMD19-T载体。阳性菌液测序结果经NCBI序列比对，与NCBI上报道的OsILP基因序列99%匹配，只有第1 040位上的碱基由 “T”变成“C”，即由“GAT”变成“GAC”，密码子由“CUA”变成“CUG”，编码同一种氨基酸（亮氨酸），此为同义改变。上述结果表明重组克隆载体 pMD19-T-OsILP 已构建成功。

2.2pTCK303-OsILP过表达载体的构建

利用位于载体pMD19-T-OsILP和表达载体pTCK303内含子两端的BamHⅠ和SpeⅠ酶切位点，分别对提取的2个载体质粒进行双酶切，回收各自目的片段（1 167、14 kb），将两者用T4-DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α。对菌液进行PCR鉴定，结果见图4-A。除阴性对照外，阳性对照和检测菌液均可以扩增出1 167 bp长的目的片段。进而提取质粒，对重组质粒进行双酶切鉴定（图4-B），1号泳道为空载体的酶切结果，在400 bp处可看到1条带，为内含子片段；2号泳道为重组载体的酶切结果，在1 200 bp左右处出现1条带，说明目标片段（1 167 bp）已正确连接到pTCK303载体中。

将所构建的过表达载体pTCK303-OsILP导入农杆菌EHA105中，农杆菌菌液PCR检测如图4-C所示，1号泳道为空载体阴性对照，2号泳道为阳性对照，3～5号泳道为不同的单克隆菌株，2～5号泳道均扩增出目的片段，说明过表达载体pTCK303-OsILP已成功导入农杆菌EHA105，可以进行下一步的愈伤转化。

2.3农杆菌介导的水稻遗传转化

以成熟胚愈伤组织为材料，与转过表达载体pTCK303-OsILP的农杆菌菌液共培养后，用含潮霉素、头孢霉素的培养基进行抗性筛选，得到抗性愈伤（图5-A），并对筛选出的抗性愈伤诱导生芽（图5-B），再将生芽植株转移至生根培养基培养生根（图5-C），获得再生抗性苗，然后移栽到盆钵（图5-D）。

2.4T0代过表达转OsILP基因水稻植株的潮霉素抗性基因检测

提取再生苗叶片基因组DNA，以潮霉素抗性基因为特异扩增对象进行PCR扩增。由图6可见，在检测的9株再生苗中有6株能扩增出预期长度的目标条带，即检测出了潮霉素抗性基因，证实带有嵌合基因的T-DNA区域已融合到水稻植株的基因组中，获得了阳性转基因植株。

3结论与讨论

采用反向遗传学技术，首先从水稻cDNA文库中扩增出了OsILP基因编码区全长序列。由于OsILP基因序列GC含量高达60%以上，使得引物的退火温度变高，普通Taq酶无法扩增出完整的目的基因全长，只能得到500～800 bp的片段。本研究采用TaKaRa公司的 LA Taq with GC Buffer Ⅰ（编码RR02AG），应用LA PCR原理研制出具有3′→5′Exonuclease活性 （Proof reading活性） 的耐热性DNA聚合酶。无论是扩增短链DNA还是长链DNA，其效率都优于其他同类产品，尤其是在扩增大于10 kb的DNA片段上，其优势更加明显，而且保真性能强。当扩增具有复杂的二级结构 （GC rich等） 的模板或重复序列的模板时，使用GC Buffer进行PCR扩增将非常有效。然而该酶虽能完整扩增出目的片段，但并不能保证测序结果与目的片段完全一致，多次试验结果均不理想，最好的试验结果是本研究中达到的99%匹配率，因是同义突变，没有改变氨基酸序列，编码蛋白与目标蛋白完全一致。

pTCK303双元表达载体是构建RNA干扰载体，使基因沉默的常用载体[10]。因其在内含子两端各自反向连入了1段目的基因，使之在转录后能形成双链RNA（dsRNA）。dsRNA 首先与Dicer酶的dsRNA结合区结合，并降解成为21～23个核苷酸的小分子干扰RNA（siRNA）。siRNA在解旋酶的作用下解链形成的反义链RNA可指导生成一种核蛋白体复合物，也叫诱导沉默复合体（RISC），在解旋酶作用下，双链RNA解链形成单链，RISC的内切酶及外切酶活性被激活，在 siRNA序列的引导下，对靶mRNA进行剪切，从而降解特定mRNA，从而使目标基因沉默[12-15]。而本研究直接利用目的基因全长替换掉载体上的内含子片段，使之成为过表达载体。

将构建的过表达载体导入农杆菌EHA105，再通过根癌

农杆菌介导的方法转化水稻愈伤。具体操作时鉴于农杆菌生长不容易控制，建议浸染后的愈伤组织一定要尽量吹干再移到共培养基，并且一定要在培养基里垫1层无菌滤纸，即使这样，在后面筛选培养基中仍须加一定浓度的头孢霉素，以防止农杆菌过度繁殖。初步筛选仅有小部分能正常生长出嫩黄色的新生愈伤组织。第2步筛选时，潮霉素浓度加倍，而头孢霉素的浓度相应降低，此时大部分愈伤组织都能正常生长，只是极个别愈伤仍会大量繁殖农杆菌，最后获得9株转基因再生苗。

T0代转基因植株的鉴定主要是以载体上的潮霉素基因为扩增对象，初步鉴定获得了6个过表达的转基因水稻植株，这为研究OsILP蛋白的表达、定位及生理功能，最终判断其是否即为水稻中的类整合素，以及研究OsILP在细胞内外信号转导中的作用奠定了基础。

4研究展望

生物信息学研究表明，OsILP的表达情况与生物胁迫、非生物胁迫、种子萌发均有关系。不仅如此，基因芯片数据库结果还显示，OsILP在水稻不同器官组织中的表达情况也各不相同，尤其在胚乳等贮藏器官中OsILP的表达量相对较高，而在叶片等营养器官中表达量相对较低。因此，OsILP的功能可能与水稻抗逆、种子萌发、籽粒胚乳发育密切相关。

OsILP是用拟南芥类整合素基因AT14A序列在水稻数据库中BLAST寻找的基因，两者的编码蛋白同属DUF677家族。笔者所在实验室已有研究表明，AT14A作为拟南芥中的类整合素，介导了细胞壁-质膜-细胞骨架连续体，在细胞的内外信号转导方面起着重要作用[3]。从结构上来看，水稻OsILP含有胞外结构域、跨膜结构域、胞内结构域各1个，其分子结构与动物整合素更为类似。结构相似提示功能可能一致，OsILP是否为水稻中的类整合素及其与水稻种子发育、萌发及响应逆境胁迫的关系，还须进一步验证。

参考文献：

[1]Bateman A，Coggill P，Finn R D. DUFs：families in search of function[J]. Acta Crystallographica Section F-Structural Biology and Crystallization Communications，2010，66（10）：1148-1152.

[2]Nagpal P，Quatrano R S. Isolation and characterization of a cDNA clone from Arabidopsis thaliana with partial sequence similarity to integrins[J]. Gene，1999，230（1）：33-40.

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[6]Triplett J W，Pavalko F M. Disruption of alpha-actinin-integrin interactions at focal adhesions renders osteoblasts susceptible to apoptosis[J]. American Journal of Physiology-Cell Physiology，2006，291（5）：C909-C921.

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[13]Bernstein E，Caudy A A，Hammond S M，et al. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J]. Nature，2001，409（6818）：363-366.

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[15]Zamore P D. RNA interference：listening to the sound of silence[J]. Nature Structural Biology，2001，8（9）：746-750.

将构建的过表达载体导入农杆菌EHA105，再通过根癌

农杆菌介导的方法转化水稻愈伤。具体操作时鉴于农杆菌生长不容易控制，建议浸染后的愈伤组织一定要尽量吹干再移到共培养基，并且一定要在培养基里垫1层无菌滤纸，即使这样，在后面筛选培养基中仍须加一定浓度的头孢霉素，以防止农杆菌过度繁殖。初步筛选仅有小部分能正常生长出嫩黄色的新生愈伤组织。第2步筛选时，潮霉素浓度加倍，而头孢霉素的浓度相应降低，此时大部分愈伤组织都能正常生长，只是极个别愈伤仍会大量繁殖农杆菌，最后获得9株转基因再生苗。

T0代转基因植株的鉴定主要是以载体上的潮霉素基因为扩增对象，初步鉴定获得了6个过表达的转基因水稻植株，这为研究OsILP蛋白的表达、定位及生理功能，最终判断其是否即为水稻中的类整合素，以及研究OsILP在细胞内外信号转导中的作用奠定了基础。

4研究展望

生物信息学研究表明，OsILP的表达情况与生物胁迫、非生物胁迫、种子萌发均有关系。不仅如此，基因芯片数据库结果还显示，OsILP在水稻不同器官组织中的表达情况也各不相同，尤其在胚乳等贮藏器官中OsILP的表达量相对较高，而在叶片等营养器官中表达量相对较低。因此，OsILP的功能可能与水稻抗逆、种子萌发、籽粒胚乳发育密切相关。

OsILP是用拟南芥类整合素基因AT14A序列在水稻数据库中BLAST寻找的基因，两者的编码蛋白同属DUF677家族。笔者所在实验室已有研究表明，AT14A作为拟南芥中的类整合素，介导了细胞壁-质膜-细胞骨架连续体，在细胞的内外信号转导方面起着重要作用[3]。从结构上来看，水稻OsILP含有胞外结构域、跨膜结构域、胞内结构域各1个，其分子结构与动物整合素更为类似。结构相似提示功能可能一致，OsILP是否为水稻中的类整合素及其与水稻种子发育、萌发及响应逆境胁迫的关系，还须进一步验证。

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将构建的过表达载体导入农杆菌EHA105，再通过根癌

农杆菌介导的方法转化水稻愈伤。具体操作时鉴于农杆菌生长不容易控制，建议浸染后的愈伤组织一定要尽量吹干再移到共培养基，并且一定要在培养基里垫1层无菌滤纸，即使这样，在后面筛选培养基中仍须加一定浓度的头孢霉素，以防止农杆菌过度繁殖。初步筛选仅有小部分能正常生长出嫩黄色的新生愈伤组织。第2步筛选时，潮霉素浓度加倍，而头孢霉素的浓度相应降低，此时大部分愈伤组织都能正常生长，只是极个别愈伤仍会大量繁殖农杆菌，最后获得9株转基因再生苗。

T0代转基因植株的鉴定主要是以载体上的潮霉素基因为扩增对象，初步鉴定获得了6个过表达的转基因水稻植株，这为研究OsILP蛋白的表达、定位及生理功能，最终判断其是否即为水稻中的类整合素，以及研究OsILP在细胞内外信号转导中的作用奠定了基础。

4研究展望

生物信息学研究表明，OsILP的表达情况与生物胁迫、非生物胁迫、种子萌发均有关系。不仅如此，基因芯片数据库结果还显示，OsILP在水稻不同器官组织中的表达情况也各不相同，尤其在胚乳等贮藏器官中OsILP的表达量相对较高，而在叶片等营养器官中表达量相对较低。因此，OsILP的功能可能与水稻抗逆、种子萌发、籽粒胚乳发育密切相关。

OsILP是用拟南芥类整合素基因AT14A序列在水稻数据库中BLAST寻找的基因，两者的编码蛋白同属DUF677家族。笔者所在实验室已有研究表明，AT14A作为拟南芥中的类整合素，介导了细胞壁-质膜-细胞骨架连续体，在细胞的内外信号转导方面起着重要作用[3]。从结构上来看，水稻OsILP含有胞外结构域、跨膜结构域、胞内结构域各1个，其分子结构与动物整合素更为类似。结构相似提示功能可能一致，OsILP是否为水稻中的类整合素及其与水稻种子发育、萌发及响应逆境胁迫的关系，还须进一步验证。

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