HBeAg转阴与HBV 基因型分布和YMDD 变异位点的相关性分析

吴艾霖，熊怡淞，王艳艳，曲远青，段小刚，吴丽娟（成都军区总医院临床实验医学研究与保障中心，成都 610083）

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性流行，但不同地区HBV 感染的具体情况差异很大。据相关研究报道显示，我国有1亿以上的HBV 感染或携带者［1－2］。乙型肝炎的实验室检测主要有血清学、病毒学、生物化学试验等，有效治疗策略也主要集中于药物抗病毒治疗，并将乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）血清学转阴作为停药的指标。但近年来临床观察发现，HBeAg血清学转阴患者停药后，也有较高的复发率，所以将血清学转阴作为停药的指标并不恰当［3－4］。HBeAg血清学转阴的原因较为复杂，主要涉及患者自身免疫功能缺陷或转换、病毒自身原因等，但由于患者自身的因素较为复杂且个体差异较大［5］。所以本研究拟从病毒自身原因的角度探讨HBeAg血清学转阴、HBV 基因型和YMDD 变异位点3者的相关性，为制定HBeAg血清学转阴的乙型肝炎患者的检测策略提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取本院2010年1月至2012年12月就诊的1200例乙型肝炎患者作为研究对象，其中男798例，女402例；年龄5～76岁，平均39.2岁。所有患者HBeAg血清学检查转阴577例，623例HBeAg 血清学检查未转阴；排除合并甲、丙、戊、庚肝及自身免疫性肝炎患者。

1.2 仪器与试剂 CFX96实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪、电泳仪、凝胶成像仪均购于美国Bio－Rad 公司；ABI3130／3130XL DNA 测序仪购于美国ABI公司；HBV YMDD 基因突变诊断试剂购于上海克隆生物高技术有限公司；HBV 基因分型和变异位点检测试剂购于北京鑫诺美迪有限公司；探针引物、TaqDNA聚合酶、DNA提取液、DNA浓缩液、DNA去离子水等均使用北京鑫诺美迪有限公司提供的试剂盒内的原装试剂。

1.3 方法1200例乙型肝炎患者均行乙型肝炎5项、乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（HBV－DNA）、乙型肝炎病毒A、B、C、D分型、YMDD 基因突变位点等检测。采用酶联免疫吸附试验法检测乙型肝炎5项，PCR 定量HBV－DNA，线性探针反向杂交法进行HBV 基因分型，各项检测均完全按照相应试剂盒说明书严格执行。

1.4 统计学处理采用SPSS20.0软件对数据进行处理及统计学分析，计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验；以α＝0.05为检验水准，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV－DNA 病毒定量检测对1200例确诊为乙型肝炎的患者进行PCR 检测，577份HBeAg 血清学转阴标本中，HBV－DNA≥103copy／mL标本共计233例，占40.38%；HBV－DNA＜103copy／mL标本共计344份，占59.62%。623份HBeAg血清学未转阴标本中，HBV－DNA≥103copy／mL的标本共计508例，占81.54%；HBV－DNA＜103copy／mL 标本共计115份，占18.46%。

2.2 HBV－DNA 阳性的HBeAg血清学转阴患者和未转阴患者的基因型分布检测对233例HBV－DNA≥103copy／mL的HBeAg血清学转阴患者标本进行乙型肝炎病毒基因型检测，分型结果显示A、B、C、D 基因型所占比例依次为69.96%（163／233）、24.46%（57／233）、4.72%（11／233）、0.86%（2／233）；对未发生HBeAg血清学转阴，且HBV－DNA≥103copy／mL的508例患者基因分型检测，A、B、C、D 基因型所占比例依次为57.48%（292／508）、36.22%（184／508）、5.71%（29／508）、0.59%（3／508）。HBV－DNA 阳性的HBeAg血清学转阴患者和未转阴患者在A、B、C、D 基因型分布上比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 HBV－DNA 阳性的HBeAg血清学转阴患者和未转阴患者的YMDD 突变率检测对HBV－DNA≥103copy／mL 的HBeAg血清学转阴患者233例和未转阴的508例患者的病历资料进行分析发现，所有患者均有拉米夫定6个月以上的服用史。YMDD 基因变异检测共发现YMDD 变异133例，其中HBV－DNA≥103copy／mL、HBeAg 血清转阴患者106例，占HBV－DNA阳性且血清学转阴患者的45.49%（106／233）；HBV－DNA≥103copy／mL、HBeAg血清未转阴患者27例，占DNA 阳性且血清学未转阴患者的5.31%（27／508），两组基因突变率比较，前者明显高于后者，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 HBeAg血清学转阴与未转阴患者的YMDD 突变情况

2.4 HBeAg血清学转阴与YMDD 突变、HBV 基因型之间的相关性分析乙型肝炎患者的YMDD 突变型多为B型和C型，明显高于A型和D型，突变位点多为V 突变。见表2。

表2 HBeAg血清学转阴与YMDD 突变、HBV 基因型的相关性（n）

3 讨论

长期以来人们普遍认为“小三阳”比“大三阳”轻，甚至更有人认为“小三阳”无需治疗。然而，越来越多的研究表明这种观点是不科学的［6－7］。本研究证实不少乙型肝炎患者经拉米夫定治疗一段时间后，虽然乙型肝炎病毒e抗原已转阴，即成为“小三阳”，但其HBV－DNA 拷贝数仍然大于或等于103，即仍然有病毒复制。倘若此时没有继续检测病毒复制的情况，仅以HBeAg转阴为停药指标，则患者病情复发迅速且复发率高，甚至出现病情加重或耐药现象，后期治疗难度较大。

抗病毒治疗是慢性HBV 感染的一项基本治疗措施。核苷酸类似物拉米夫定作用于HBV 多聚酶活性部位YMDD 基因序列，从而抑制HBV－DNA 复制，抗病毒效果明显［8－10］。但临床上部分患者可表现为无应答或随着用药时间的延长，HBV 发生突变并导致对拉米夫定耐药，影响拉米夫定的疗效。本研究通过使用YMDD 诊断试剂盒，对收集的1200份乙型肝炎患者血清标本检测基因突变位点，结果表明HBeAg血清学转阴的患者仍然存在基因位点变异，并且这部分患者的突变率明显高于HBeAg 血清学未转阴的患者。因此，笔者分析HBeAg血清学转阴，可能只是因为YMDD 位点发生了突变，实际上其病毒仍然处于不断复制中。杨彦麟等［11］对HBeAg阳性患者中HBV 基因型分布及YMDD 变异位点的分析，显示HBeAg阳性患者的基因型突变率达到35.34%，但笔者的研究发现HBeAg阴性患者的基因型也会发生突变，并且突变率高达45.49%。因此，对HBeAg阴性患者不能放松警惕，应持续或定期监测HBV－DNA 拷贝数。

本研究结果显示，乙型肝炎患者的YMDD 突变型多为B型和C型，明显高于A型和D型，突变位点多为V型，这与相关研究结果一致［11］。说明长期服用拉米夫定易使患者发生YMDD 突变，尤其是B型和C型的突变，从而出现HBV 对拉米夫定耐药，进而在临床检查上出现HBeAg阴性，但乙型肝炎病毒拷贝数仍走高的情况，不利于患者后期的抗病毒治疗。本研究提示HBeAg血清学转阴、HBV 基因型、YMDD 基因突变3者具有一定的关联，在临床抗病毒治疗上不能只考虑其中1个因素，而应该综合考虑以上因素，优化乙型肝炎抗病毒治疗方案，达到最佳效果。

综上所述，乙型肝炎患者的HBeAg血清学转阴、HBV 基因型、YMDD 基因突变3者具有一定的关联，应予以密切关注。

［1］陈先礼，况雪梅，杨红.慢性HBV 感染者性别及HBeAg模式与血清HBV DNA 水平的关系［J］.传染病信息，2013，26（1）：42－44.

［2］Liang X，Bi S，Yang W，et al.Epidemiological serosurvey of hepatitis B in China－－declining HBV prevalence due to hepatitis B vaccination［J］.Vaccine，2009，27（47）：6550－6557.

［3］Ott JJ，Stevens GA，Groeger J，et al.Global epidemiology of hepatitis B virus infection：New estimates of age－specific HBsAg seroprevalence and endemicity［J］.Vaccine，2012，30（12）：2212－2219.

［4］杨艳秋.366例疑似乙型肝炎患者HBV－DNA 检测与乙肝5项指标结果分析［J］.大理学院学报，2007，6（1）：276－278.

［5］荣海燕，张朝霞.乙型肝炎病毒耐药突变与HBV－DNA 量和HBeAg之间的相关性研究［J］.实用医学杂志，2013，29（3）：404－406.

［6］陈健康，肖敏敏，黄升海.乙型肝炎YMDD 变异与丙氨酸转氨酶乙型肝炎病毒e抗原及乙型肝炎病毒DNA 的关系探讨［J］.实用医技杂志，2010，17（4）：301－303.

［7］柳文菊，江培学，朱汝祥.3种检测乙型肝炎病毒YMDD变异方法的比较［J］.检验医学，2012，27（7）：557－560.

［8］Liaw YF，Sung JJ，Chow WC，et al.Lamivudine for patients with chronic hepatitis B and advanced liver disease［J］.N Engl J Med，2004，351（15）：1521－1531.

［9］Di Marco V，Marzano A，Lampertico P，et al.Clinical outcome of HBeAg－negative chronic hepatitis B in relation to virological response to lamivudine［J］.Hepatology，2004，40（4）：883－891.

［10］张照华，孟红.乙型肝炎病毒YMDD 变异研究进展［J］.中华实验和临床感染病杂志：电子版，2008，2（2）：88－92.

［11］杨彦麟，肖萍，高鹏，等.HBeAg阳性患者中乙型肝炎病毒基因型分布及YMDD 变异位点分析［J］.临床肝胆病杂志，2012，28（6）：428－430.