siRNA沉默CEACAM1基因对人胶质瘤SHG44细胞生物学行为的作用

许刚柱，张 鹏，李 文，赵 慧，吴 涛，张俊锋，王茂德

(1西安医学院第一附属医院神经外科，西安710077;2西安医学院临床医学院外科学教研室;3西安交通大学医学院第一附属医院神经外科;*通讯作者，E-mail:xgz917@126.com)

脑胶质瘤的发病率位居颅内原发性肿瘤首位，呈恶性侵袭性发展，预后常较差。癌胚抗原相关细胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM1)是癌胚抗原(CEA)基因家族成员之一，CEACAM1在多种肿瘤中可以影响其增殖、凋亡、侵袭及转移等［1－3］。然而关于CEACAM1在胶质瘤中的作用还不十分清楚。本研究以CEACAM1基因作为靶点，设计针对CEACAM1基因的siRNA，转染人胶质瘤SHG44细胞后观察其对细胞生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

SHG44细胞由本实验室保存。转染试剂LipofectamineTM2000购自于Invitrogen公司。RPMI1640细胞培养液与胎牛血清(FBS)购自于HyClone公司，兔抗人CEACAM1单克隆抗体购自Epitomics公司。兔抗人β-catenin单克隆抗体和兔抗人Cyclin D1单克隆抗体北京中杉金桥公司。兔抗人GAPDH多克隆抗体购自赛诺博公司，CCK-8试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司，HRP标记的羊抗兔IgG(H+L)二抗购自陕西先锋生物科技有限公司，细胞周期检测试剂盒购自Becton Dickinson(BD)公司，BCA蛋白定量试剂盒与ECL化学发光液购自PIERCE公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的设计与合成 根据GenBank登录的CEACAM1基因序列(NM_001712.4)和RNAi的设计原则分别设计3段siRNA。①目标干扰位点1674－1696，设计正义链:5’－CAGCCACAGAAAUAAUUUATT－3’，反义链:5’－UAAAUUAUUUCUGUGGCUGTT－3’，命名为CEACAM1-siRNA1;②目标干扰位点2889－2911，设计正义链:5’－CUACCAUUCUAUUCCAUGUTT－3’，反 义 链:5’－ACAUGGAAUAGAAUGGUAGTT－3’，命名为 CEACAM1-siRNA2;③目标干扰位点 3130－3152，设 计 正 义 链:5’－CAGCCUCUGAAAUUUAUCUTT－3’，反义链:5’－AGAUAAAUUUCAGAGGCUGTT－3’，命名为 CEACAM1-siRNA3。siRNA序列经BLAST(http://nlm.nih.gov/BLAST/)检索证实与CEACAM1以外的其他基因无同源性。另外设计一段不针对任何基因的siRNA序列作为阴性对照，正义链:5’－UUCUCCGAACGUGUCACGUTT－3’，反义链:5’－ACGUGACACGUUCGGAGAATT－3’。以上序列均由上海生物工程公司合成。

1.2.2 细胞培养与转染 将SHG44细胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，5%CO2、37℃、饱和湿度条件下进行培养。将对数生长的SHG44细胞培养到96孔板中，待细胞密度达到70% 时，进行转染，初期实验分为5组:正常对照组(细胞未经任何处理)，阴性对照组(转染非特异性siRNA)，CEACAM1-siRNA1组，CEACAM1-siRNA2组和 CEACAM1-siRNA3组。用LipofectamineTM2000作为转染试剂，按siRNA转染说明书操作，转染后继续培养48 h。

1.2.3 Westernblot法检测 RNA 干扰对 CEACAM1及Wnt信号通路相关蛋白表达的影响 于转染SHG44细胞48 h后，提取转染细胞系的总蛋白，用BCA法测定蛋白含量，总蛋白在10%凝胶中电泳后，电转至硝酸纤维素膜，封闭液(5%脱脂奶粉和0.05%Tween-20 TBS缓冲液)中4℃过夜;分别加入一抗CEACAM1单克隆抗体(1∶1 000)、β-catenin单克隆抗体(1∶1 000)和 Cyclin D1单克隆抗体(1∶1 000)及 GAPDH 多克隆抗体(1∶1 000)，室温1 h，TBS-T洗膜3次，结合HRP标记的羊抗兔IgG(H+L)二抗1 h，TBS-T洗膜3次，ECL化学发光试剂检测，计算机扫描图像，测出各条带面积灰度值。实验重复3次取均值。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖 于转染后将培养板在培养箱中分别孵育 0 h、24 h、48 h、72 h、96 h，每组设5个复孔，然后向每孔加入10μl CCK-8溶液，再在培养箱内孵育2 h，用酶标仪在450 nm处检测每组吸光度OD值。

1.2.5 流式细胞仪分析细胞周期 转染48 h后用0.25%胰酶消化并收集各组细胞，PBS洗涤细胞1次，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入预冷的70%乙醇1 ml固定4℃环境下过夜。染色前用PBS洗1次，加入150μl RNaseA重悬细胞，37℃消化30 min。加100μl PI(50μg/ml)染液染色30 min，流式细胞仪检测并计算细胞周期的分布率。

1.2.6 Transwell小室检测细胞迁移能力 转染后48 h胰酶消化各组细胞，无血清培养基重悬后稀释成1×106个/ml，将100μl细胞悬液接种于Transwell小室上层，下室中加入含10%FBS的DMEM高糖培养基。37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24 h，取出上室，用湿棉签轻轻擦拭掉未穿过膜的细胞，4% 多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色。用蒸馏水冲净浮色，显微镜(×200)下计数穿过滤膜细胞数。

1.2.7 细胞体外侵袭实验 用50 mg/L Matrigel处理Transwell小室的聚碳酸滤膜(滤膜孔径为8 μm)小室底部膜的上室面，并在室温下过夜干燥。转染后48 h胰酶消化各组细胞，无血清培养基重悬调整细胞浓度为1×106个/ml，吸取100μl细胞悬液加至Transwell小室上室，下室加入600μl完全培养液，37℃、5%CO2条件下继续培养24 h，用棉签擦去滤膜上层细胞，4%多聚甲醛固定30 min，行结晶紫染色，显微镜(×200)下计数穿过滤膜细胞数。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 转染后CEACAM1蛋白在SHG44细胞中的表达

转染48 h后Western blot结果显示，siRNA转染组CEACAM1蛋白水平低于正常对照组和阴性对照组，其中CEACAM1-siRNA3转染后CEACAM1降低最为明显，分别测定各条带灰度值，计算出CEACAM1-siRNA1、CEACAM1-siRNA2 和 CEACAM1-siRNA3细胞中CEACAM1蛋白表达抑制率分别为31.7%，41.2%和73.6%，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01，见图1)。根据Western blot结果，选择CEACAM1-siRNA3沉默CEACAM1基因的表达，进行后续试验，实验分为3组:正常对照组(细胞未经任何处理)、阴性对照组(转染非特异性siRNA)、CEACAM1-siRNA组(转染CEACAM1-siRNA3)。

2.2 siRNA对SHG44细胞增殖的影响

CCK-8细胞增殖实验检测结果提示，转染48 h后CEACAM1-siRNA组与正常对照组及阴性对照组比较，细胞生长明显受到抑制，差异有统计学意义(P＜0.05，见表1)。

2.3 流式细胞仪检测细胞周期

流式细胞术检测细胞周期时相分布，结果发现:正常对照组和阴性对照组细胞在G0/G1期、S期、G2/M期所占比例接近，差异无统计学意义(P＞0.05);CEACAM1-siRNA组的G0/G1期细胞比例增多、S期细胞比例减少，与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05，见表2)，表明CEACAM1-siRNA诱导SHG44细胞出现G0/G1期阻滞。

图1 siRNA对SHG44细胞CEACAM1蛋白表达的影响Figure 1 Effect of siRNA on the CEACAM1 protein expression in SHG44 cells

表1 siRNA下调CEACAM1对SHG44细胞增殖的影响(±s，%)Table 1 Effect of siRNA targeting CEACAM1 on proliferation of SHG44 cells(±s，%)

表1 siRNA下调CEACAM1对SHG44细胞增殖的影响(±s，%)Table 1 Effect of siRNA targeting CEACAM1 on proliferation of SHG44 cells(±s，%)

与正常对照组比较，*P＜0.05

CEACAM1-siRNA 组 0.226±0.023 0.227±0.022 0.253±0.029 0.408±0.015* 0.612±0.017*

表2 siRNA下调CEACAM1对SHG44细胞周期的影响(±s，%)Table 2 Effect of siRNA targeting CEACAM1 on cell cycle of SHG44 cells(±s，%)

表2 siRNA下调CEACAM1对SHG44细胞周期的影响(±s，%)Table 2 Effect of siRNA targeting CEACAM1 on cell cycle of SHG44 cells(±s，%)

与正常对照组比较，*P＜0.05

CEACAM1-siRNA 52.6±1.835.1±1.612.4±0.8

2.4 细胞迁移实验结果

正常对照组、阴性对照组以及 CEACAM1-siRNA组SHG44细胞迁移数目分别为70.32±3.36、68.28±5.64 和 32.30±4.28，CEACAM1-siRNA组迁移平均细胞数显著低于正常对照组、阴性对照组(P＜0.05);而两组对照组之间，差异无显著性(P=0.221)，提示siRNA沉默CEACAM1基因表达后可以显著抑制SHG44细胞迁移能力。

2.5 细胞侵袭实验结果

正常对照组、阴性对照组以及CEACAM1-siRNA组SHG44细胞穿膜数目分别为:25.36±4.38、23.19±3.62 和 12.72±3.57，CEACAM1-siRNA 组穿膜细胞数较正常对照和阴性对照组穿膜细胞数显著减少(P＜0.05)，其相对侵袭力仅为空白对照组的50.3%，说明 CEACAM1表达下调可以抑制SHG44细胞的体外侵袭能力。

2.6 siRNA对Wnt信号通路相关蛋白β-catenin和Cyclin D1表达的影响

Western blot结果显示，CEACAM1-siRNA组中β-catenin和Cyclin D1的蛋白水平与正常对照组比较明显下降，正常对照组和阴性对照组之间的差异无统计学意义(见图2)。

图2 siRNA对SHG44细胞β-catenin和Cyclin D1表达的影响Figure 2 Effect of siRNA transfection onβ-catenin and Cyclin D1 protein expression in SHG44 cells

3 讨论

胶质瘤多呈侵袭性生长，不易完全切除，且多数恶性胶质瘤细胞对放疗及化疗不敏感，临床治疗效果较差，所以探索新的治疗方法具有极其重要的临床意义。CEACAM1的生物学功能十分复杂，在不同肿瘤中的作用也不尽相同，甚至呈现相反的作用［1－3］:CEACAM1在多种肿瘤如前列腺癌、肝癌、结肠癌和膀胱癌中的表达普遍下降，故被认为是一种肿瘤抑制因子［4－7］;但在舌癌、肺癌、胰腺癌、胶质瘤和恶性黑色素瘤中CEACAM1表达增加，有可能促进恶性肿瘤的进展和迁移［8－12］。

目前国内外有关胶质瘤中CEACAM1的研究相对较少，在SHG44细胞株中的表达及其与细胞增殖、迁移及侵袭的关系也未见报道。本课题组前期研究［11］通过免疫组织化学的方法，检测了人脑胶质瘤中 CEACAM1的表达情况，发现在胶质瘤中CEACAM1可能是一个促进肿瘤发生、发展的因素。因此，本研究旨在利用siRNA技术进一步探讨CEACAM1对胶质瘤SHG44细胞生物学行为的影响，结果表明沉默CEACAM1表达可能是治疗脑胶质瘤一种新的有效途径。

本实验通过体外化学合成针对CEACAM1基因设计的siRNA序列，转染后48 h与正常对照组及阴性对照组相比，干扰组CEACAM1的表达明显下降，提示所设计siRNA序列可以特异性地降低CEACAM1在胶质瘤细胞中的表达，用CCK-8法检测转染前后细胞增殖的影响，发现干扰后SHG44细胞生长显著慢于正常对照组和阴性对照组，提示在胶质瘤中CEACAM1可能促进肿瘤细胞增殖，这与舌癌、肺癌、胰腺癌和恶性黑色素瘤中报道的CEACAM1 效应一致［8－10，12］。流式细胞仪检测结果发现:CEACAM1的表达抑制使细胞周期停滞在G0/G1，导致SHG44细胞中G0/G1期细胞增加，S期和G2/M期细胞减少。β-catenin、Cyclin D1是 Wnt信号通路的重要组成成分，具有调节细胞增殖、抑制细胞分化及调控细胞周期等重要作用［13］。Western blot结果显示 CEACAM1-siRNA组中 β-catenin和Cyclin D1的蛋白水平明显下降(图2)，进一步说明干扰CEACAM1基因表达可以延缓细胞周期进程，抑制细胞增殖。作为β-catenin的目标蛋白之一，Cyclin D1在SHG44和BT325胶质瘤细胞进入G1期的早期发挥着重要的生物学作用［14］，在肿瘤细胞中，由于β-catenin的表达增加，降解减少，从而在肿瘤细胞内蓄积，激活Cyclin D1基因的转录和翻译过程，使得肿瘤细胞内的Cyclin D1蛋白含量上升，从而促进细胞周期G1/S期之间的转换，促进肿瘤细胞的周期进程和增殖［15］。有研究表明，CEACAM1作为一个细胞活动中的重要调节因子，可以通过Wnt信号通路促进肿瘤进展和血管发生［16］，而胶质瘤的发生、发展也与Wnt信号系统激活密切相关［17］，本实验研究结果表明 CEACAM1-siRNA抑制胶质瘤细胞增殖的作用可能是通过下调Wnt信号通路中的靶基因β-catenin和Cyclin D1的表达实现的。

浸润和转移是恶性肿瘤的重要生物学特征之一，也是导致肿瘤患者死亡的主要原因，而肿瘤细胞的迁移及侵袭则是肿瘤浸润和转移的必要条件。在肺癌［18］、胃癌［19］中 CEACAM1 的高表达使得癌细胞更易于转移;在肝母细胞瘤患者［20］及鼠类畸胎癌细胞株(F9DR)［21］中CEACAM1表达的缺失则可能促进了转移;在甲状腺癌中CEACAM1表现为限制肿瘤生长，但却增加转移侵袭的机会［22］。以前认为结肠癌中CEACAM1缺失有利于肿瘤发生［23］，但最近的研究［24］却认为结肠直肠癌中CEACAM1过表达与临床分期密切相关，CEACAM1-L表达与结直肠癌病人的肿瘤转移和较短的生存明显相关，且通过划痕实验及侵袭小室实验表明CEACAM1再次表达，说明CEACAM1-L促进了迁移和侵袭。以上各项研究说明不同肿瘤中CEACAM1的角色并不一样。本研究通过Transwell小室实验观察SHG44细胞的迁移和侵袭能力的改变，结果显示，与正常对照组和阴性对照组比较，干扰组SHG44细胞迁移及穿膜的数目降低，说明CEACAM1-siRNA能显著抑制SHG44细胞的体外迁移及侵袭能力，实验结果相似于最近在结肠癌细胞中的研究结论:CEACAM1可以借助调节N－钙黏蛋白的表达抑制结肠癌的细胞与基质黏附，促进细胞迁移［25］。在 SHG44细胞中下调CEACAM1的表达抑制肿瘤细胞迁移及侵袭能力的确切机制还有待于进一步的研究。

总之，本研究通过siRNA技术下调SHG44细胞中CEACAM1的表达，观察到SHG44细胞增殖减慢，细胞周期阻滞在G0/G1期，体外迁移和侵袭能力下降，结果提示CEACAM1有望成为一个胶质瘤的分子治疗靶点。

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