反硝化聚磷菌菌剂种子液制备条件及除磷机理

张文艺，陈 晶，邓 文，陈 萍，周新程

（常州大学 环境与安全工程学院，江苏 常州 213164）

反硝化聚磷菌（denitrifying poly－phosphate accumulating microorganisms，DNPAOs）是一类既以氧为电子受体又以硝酸盐为电子受体聚磷的菌群。在厌氧环境中DNPAOs释放体内的多聚磷酸盐颗粒（Poly－P）获得能量吸收水体中的挥发性脂肪酸，将其储存为聚羟基脂肪酸酯（PHA）；在好氧（缺氧）环境中再消耗PHA，以氧气或硝酸盐为电子受体吸收水中的磷，并在菌株体内再次合成Poly－P［1］，所以菌株体内Poly－P分解与合成在DNPAOs同步脱氮除磷中处于核心地位。针对DNPAOs的富集、分离和除磷特性已有大量研究，如Chaudhry等［2］考察各种碳源和氮源影响，制得一种PAM培养基用于筛选环境样品中的聚磷菌，Ahn等［3］在厌氧阶段初期投加少量NO3－有利于DNPAOs的富集，且将电子受体由氧气转变为NO3－有利于DNPAOs缺氧吸磷的活力。Weissbrodt等［4］研究了在生物膜中的聚磷菌Accumulibacter和聚糖菌Competibacter富集触发因素有pH、温度和氧化还原电位，当pH大于7.3、温度小于20℃和充分好氧时会使聚磷菌成为优势菌种。而在Lanham［5］研究中指出从抑制聚糖菌生长来富集聚磷菌可能会降低聚磷菌的除磷效能，其原因在于聚磷菌存在代谢系统的易变性，聚磷菌的代谢途径分为糖酵解和三羧酸循环，聚糖菌的存在有利于聚磷菌利用糖酵解进行代谢从而具有更高的除磷效率。

中国污水处理厂多采用氧化沟和A2／O工艺，在原理上有利于聚磷菌发挥其效能，但多数污水处理厂均不同程度存在磷去除率不高的问题，其原因在于聚磷菌与硝化菌、聚糖菌等存在碳源竞争，若聚磷菌在活性污泥中失去种群优势，则活性污泥中的聚磷菌很难大量繁殖。污水处理厂为确保出水达标排放，只得采用投加大量的化学药剂［6］，但这又会带来成本过高和污泥量增加的问题，最终造成运行成本过高，尤其是采用BOT模式建造的污水处理厂更是苦不堪言。

目前，对于DNPAOs的研究处于起步阶段，中国已筛得大量反硝化聚磷菌的报道，其大多研究［6－10］将富氮磷培养基作为模拟废水，DNPAOs接种于培养基中改变培养基的pH、温度、溶解氧等，得到菌株在培养基中摄取氮磷量最高时的处理条件。任世英等［7］提出了利用△OD480及其形成的多聚磷酸盐菌体比例2项指标来描述海洋聚磷菌（Halomonas YSR－3）的除磷特性，但在 DNPAOs菌株Poly－P培育、菌剂种子液制备以及实际污水处理应用方面的研究鲜有报道。因此，从聚磷菌除磷机理出发，以提高反硝化聚磷菌体内的Poly－P含量为目标，从安徽省天长市污水处理厂具有较高除磷效率（70%～80%）活性污泥中获取的反硝化聚磷菌进行优化培养，对菌剂发酵使用的种子液制备条件做了初步探究，以期为反硝化聚磷菌菌剂制备与发酵法批量化生产提供技术参考和理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 以BOT方式运营的安徽省天长市城市污水处理厂经过近3a反复培养驯化活性污泥和工艺优化，其出水TP全年达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB 18918—2002）一级A标准。笔者以该厂采自氧化沟外沟活性污泥为菌源，分离得到具有反硝化功能的聚磷菌B8（本实验室命名，且已送中国科学院微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.9168），通过生理生化测试和DNA测序鉴定为恶臭假单胞菌属（Pseudomonas putida）。B8菌株具有多聚磷酸盐颗粒和聚－β－羟丁酸（PHB）颗粒，同时又具有反硝化产气功能，在富磷氮培养基中具有明显同步脱氮除磷性能。对B8平板培养2d后，观察其生长状况良好，长成直径为1.28mm，白色，不透明，边缘光滑，表面凸起，具有粘性和臭味的圆形菌落，培养48h后菌株变黄。对其进行生理生化特性测定，革兰氏染色、乙酰甲基醇（V.P）、甲基红（M.R）、淀粉水解和葡萄糖发酵皆为阴性，接触酶、明胶水解、葡萄糖氧化和产硫化氢均为阳性。

1.1.2 培养基 PAM高磷含量聚磷菌培养基：（NH4）2SO42.75g／L，Na2HPO430.6g／L，KH2PO43g／L，MgSO4·7H2O 0.25g／L，CaCl20.25g／L，柠檬酸钠 4.0g／L，NaCl 2.5g／L，蔗糖0.01g／L，琼脂粉20g／L［2］。聚磷菌种子培养液即为PAM中不加琼脂，其用于菌剂种子的培养。

PAM－TBO多聚磷酸盐颗粒染色培养液：1L的聚磷菌种子培养液中加入0.025g甲苯胺蓝。其作用为菌株内多聚磷酸盐颗粒含量的表征，有目的地培育内含高含量 Poly－P菌株［2］。

NB培养基：蛋白胨10g／L，牛肉膏3g／L，NaCl 5g／L，pH 7.2～7.4［11］。其作用为监测菌株的生长情况，即OD600的测定。

灭菌条件：1.03×105Pa，121℃，20min。

1.2 方法

1.2.1 多聚磷酸盐颗粒染色培育方法 依据Vasvi Chaudhry快速鉴定聚磷菌方法［2］，将菌株接种于液体PAM中，设置3个平行样，对菌株进行不同培养条件下的培养制得反硝化聚磷菌菌剂种子液，再加入发酵菌液体积2%的PAM－TBO，置于30℃下静置避光染色24h，按同样的操作制作空白。对种子液和空白经8000r／min离心15min，对上清液分别在625nm处测定其吸光度，以此来表征多聚磷酸盐颗粒在种子液中的含量。

式中：A0为未接菌菌液在PAM－TBO于625nm处的吸光度，A；A为接菌后菌液在PAM－TBO于625nm处的吸光度，A。

1.2.2 种子液除磷实验 将用无菌水4000r／min离心15min清洗2～3次后的B8菌剂种子液按10%接菌量投加至高温蒸汽灭菌后的污水（取自江苏省常州市马杭污水处理厂格栅前进水口，水质为CODCr267.2～274.4mg／L，TP 4.0～4.5mg／L，NO3－—N 35.0～36.5mg／L）后，分别进行厌氧－好氧流程和厌氧－缺氧流程处理。厌氧－好氧流程和厌氧－缺氧流程具体操作为：将加了菌的水样置于密闭容器中充入氮气后，置于30℃中转子30r／min搅拌4h，此为厌氧处理；再将水样置于敞口容器中预曝气充氧后再持续搅拌12h（30℃、160r／min），相当于正常好氧状态下溶解氧的79%～95%，此为好氧处理；缺氧处理为将水样置于敞口容器中进行间歇低速搅拌12h（每隔55min低速60r／min、30℃搅拌5min）其中的溶解氧相当于正常好氧状态下溶解氧的24%～46%［12］，两流程中的厌氧处理操作相同。处理后每隔1h取水样，再将水样离心（8000r／min，15min）取上清液，分别对水样中的TP、NO3－—N测定来连续追踪脱氮除磷进程，同时对处理废水中的菌株生长量OD600进行测定。除磷率、硝酸盐氮去除率的计算式为

式中：P为除磷率或硝酸盐氮去除率，%；B0为水样初始的TP或NO3－—N浓度，mg／L；B为处理后水样的TP或NO3－—N浓度，mg／L。

1.2.3 种子液中菌株胞外聚合物提取方法 取待处理废水10%的菌剂种子液进行4000r／min离心15min，使用无菌水清洗2次后，重悬至原体积后，使用超声破碎仪（40W、60s）进行超声破碎，再进行冷冻离心（20000r／min、4℃）20min，收集上清液，此即含有菌株的胞外聚合物［8］。

1.2.4 分析方法 1）菌株多聚磷酸盐颗粒PAMTBO染色率（%）：吸光度法，用721分光光度计在光密度为625nm处测定PAM－TBO静置避光染色24h后上清液的吸光度值，同时对空白样的PAMTBO染色后的吸光度值进行测量，按式（1）计算［2］。

2）水质测定方法依据国家环保总局编的《水和废水监测分析方法（第4版）》［13］。其中总磷采用过硫酸钾消解－钼锑分光光度法；硝酸盐氮采用酚二磺酸分光光度法。

3）菌体生长量（A）：吸光度法，用721分光光度计在光密度为600nm处测定吸光度值［6］。

2 结果与分析

2.1 反硝化聚磷菌B8菌剂的种子液制备条件分析

2.1.1 种子液培育时间 培养时间与菌龄紧密相关，培养时间过短聚磷菌的多聚磷酸盐颗粒含量偏低，而过长的培养时间又会导致反硝化聚磷菌出现多聚磷酸盐颗粒分解的现象，所以培养时间是发挥反硝化聚磷菌除磷效能的关键因素，也是制备反硝化聚磷菌菌剂的核心因素。将B8菌株接入50mL PAM 中摇培（140r／min、30 ℃、pH 6.5）5～35h后，在分别接入1mL的PAM－TBO静置避光染色24h后进行聚磷菌多聚磷酸盐颗粒含量评价。由图1可以看出，B8菌株PAM－TBO染色率是先快速上升于47.57%，短期稳定于56%左右后下降，最后下降于2.46%，这是由于在菌株培育25h时有少量菌株死亡，多聚磷酸盐颗粒含量下降，其后虽又有菌株继续繁殖，但其多聚磷酸盐颗粒含量不再增加，说明菌株合成多聚磷酸盐颗粒激酶活力已大大降低，所以B8菌株适宜培养时间应为15～20h。

图1 培养时间对反硝化聚磷菌B8生长的影响

2.1.2 种子液培育温度 在污水生物处理过程中，微生物衰减包括细胞死亡和功能性微生物活性的丧失［14］，过高或过低的温度都不利于反硝化聚磷菌的繁殖与其体内多聚磷酸盐颗粒的培育。将B8菌株接入50mL PAM 中摇培（140r／min、pH 6.5）20h后，再分别接入1mL的PAM－TBO静置避光染色24h后进行聚磷菌多聚磷酸盐颗粒含量评价，其中考察培养温度范围为20～40℃，其结果如图2所示。由该图可以看出，B8菌株PAM－TBO染色率是先快速上升于56.47%，随后快速下降，最后下降于6.47%，这是由于在菌株培育温度太低或太高，菌株不易繁殖，菌体内多聚磷酸盐颗粒含量也较低，即B8除磷活性较低。因此，B8菌株适宜的培养温度应为30～32℃。

图2 温度对反硝化聚磷菌B8生长的影响

2.1.3 种子液饱和溶解氧（摇床培育转速） 摇床转速反映了培养液中溶解氧含量，有研究表明：当培养液为200mL，在培养的0～48h内，摇床转速100r／min，相当于55%～74%饱和溶解氧；摇床转速160r／min，相当于79%～95%饱和溶解氧［12］。同时，摇床转速也会反映菌株机械承受力水平，由于在大部分菌剂制备工艺中会采用机械搅拌来增加氧通量，若反硝化聚磷菌的机械承受力不强则易自溶破裂，将可能会引起菌剂除磷效能降低的结果。在该研究中将B8菌株接入50mLPAM中摇培（培养温度30℃、pH 6.5）20h后，在分别接入1mL的PAM－TBO静置避光染色24h后进行聚磷菌多聚磷酸盐颗粒含量评价，其中考察摇床转速范围是80～180r／min，得到实验结果。由图3可以看出，B8菌株PAM－TBO染色率在摇床转速80～180r／min范围内有一次起伏，在120r／min时PAM－TBO染色率最高为64.83%。在一开始摇床转速设为80r／min时，B8菌株PAMTBO染色率仅为19.53%，是由于摇床转速过慢导致培养液营养分布不均匀和供氧量不足使B8菌株多聚磷酸盐颗粒含量较低。随着摇床转速的增加，B8菌株PAM－TBO染色率快速增至64.83%。摇床转速大于120r／min后，B8菌株PAM－TBO染色率平稳降至42.15%，这是由于摇床转速过大致使菌株间的碰撞频率增加从而减少溶解氧向菌株胞内的运输，影响B8菌株的正常生长和其多聚磷酸盐颗粒的培育。所以50mL B8菌液适宜摇床培养转速为120～140r／min，即70%至88%饱和溶解氧。

图3 摇床转速对反硝化聚磷菌B8生长的影响

2.1.4 菌剂种子液培育酸碱度（pH条件） 不同微生物均有适合其生长和发挥其特殊功能的酸碱度，即pH。在该研究中，将B8菌株接入50mL PAM中摇培（培养温度30℃；摇床转速120r／min）20h后，再分别接入1mL的PAM－TBO静置避光染色24h后进行聚磷菌多聚磷酸盐颗粒含量评价，其中考察pH范围是5.5～8.0，得到实验结果。由图4可知，随着pH的增加，B8菌株PAM－TBO染色率快速增至61.03%。pH大于6.5后，B8菌株PAMTBO染色率缓慢降至24.22%，说明偏酸与偏碱都会对种子液中的B8菌株的繁殖和体内多聚磷酸盐颗粒的合成产生不利影响，而pH对B8菌株体内的多聚磷酸盐颗粒合成的影响程度更大。在偏酸条件下，虽菌体生长量较大，但由于Poly－P是多聚阴离子，较低的pH 会促使菌体内Poly－P水解［15］，所以图4中在pH小于6.5时的PAM－TBO染色率较低。由此可得B8菌剂种子液制备pH条件应为6.5～7.0。

图4 pH对反硝化聚磷菌B8生长的影响

2.2 反硝化聚磷菌B8菌剂种子液除磷特性

在培养温度为30℃；转速为120r／min；pH 6.5条件下培育20h得到高Poly－P含量的反硝化聚磷菌B8菌剂种子液，对处理废水量10%的反硝化聚磷菌B8菌剂种子液进行清洗后，再将其投加入去除杂菌后的待处理污水中，厌氧处理4h再分别进行好氧和缺氧处理12h，其中每隔1h取水样后测TP和NO3－—N，从而便于对反硝化聚磷菌B8菌剂种子液除磷特性进行分析。

2.2.1 好氧聚磷特性 由图5中可以看出B8具有聚磷菌的厌氧释磷和好氧超量吸磷的特性，进水TP 4.40mg／L经4h厌氧释磷为5.80mg／L，经5h好氧处理后TP降为0.26mg／L，随后少量B8除磷能力下降，使水中TP上升至1.22mg／L。而在好氧除磷过程中，NO3－—N浓度并无明显变化，其硝酸盐氮去除率在1.32%至2.13%范围内波动。在厌氧阶段聚磷菌会释磷吸收碳源形成PHA用于菌体储存能量，在好氧阶段会消耗PHA吸收处理水中的磷到菌体内形成多聚磷酸盐颗粒［16］，在B8处理第13h有菌体死亡溶解在水中，菌体的死体增加了水中的碳源，促进了其剩下菌体的聚磷活力和繁殖能力，使处理水中的TP有3个小范围的波动，平均循环时间为4h，第1个循环的除磷效率最高，这也可间接证明聚磷菌在先厌氧再好氧条件下的聚磷率高于单纯好氧条件下的聚磷率［17］。B8菌株可以在较短的时间内发挥高聚磷能力，且在补给少量碳源后会刺激B8持续发挥其聚磷能力，其聚磷率保持在80%左右。综上所述，所制得的反硝化聚磷菌B8菌剂种子液具有高效的好氧除磷能力，经厌氧4h和好氧5h后除磷可达94.09%，但未见好氧反硝化现象。

图5 出水总磷浓度及脱氮除磷率的变化

2.2.2 缺氧反硝化脱氮聚磷特性 由图6中可以看出B8具有反硝化聚磷菌的厌氧释磷和缺氧超量吸磷的特性，进水TP 4.38mg／L经4h厌氧释磷为5.87mg／L，经12h缺氧处理后TP降为0.45mg／L，同时进水NO3－—N 35.94mg／L也降为16.72mg／L。在缺氧处理前5h硝酸盐氮去除率与除磷率基本相近，而在此之后由于间歇搅拌使处理废水中溶解氧逐渐增高，超过了菌株繁殖所需氧量，使菌株吸收水中的磷开始繁殖，所以除磷率开始明显超过硝酸盐氮去除率，同时OD600也开始上升。彭赵旭等［9］发现与水中溶氧相比，NO3－—N作为吸磷过程电子受体时效率偏低。将缺氧除磷与好氧除磷进行对比，可以看出缺氧除磷的效率确实较低，但其具有减少曝气成本和产泥量少的优点。综上所述，所制得的反硝化聚磷菌B8菌剂种子液具有高效的反硝化除磷能力，经厌氧4h和缺氧12h后硝酸盐氮去除率可达53.48%、除磷率可达89.73%。

图6 出水总磷浓度及脱氮除磷率的变化

2.3 反硝化聚磷菌B8菌剂种子液的同步脱氮、除磷机理分析

目前普遍认可“聚合磷酸盐累积微生物”（简称为聚磷菌）的摄／放磷原理，即聚磷菌先在厌氧环境中水解体内的ATP用于形成ADP和能量并分解菌株内的Poly－P，然后以PO43－的形式释放。同时聚磷菌利用糖酵解产物（NADH2）和能量吸收碳源储存形成PHA（其中包括PHB）于菌体内。继而聚磷菌在好氧环境中以O2为电子受体氧化分解PHB产生能量完成繁殖代谢，同时吸收外部环境中的磷酸盐再次于体内形成Poly－P，而菌株厌氧放磷量远大于好氧摄磷量，所以通过聚磷菌的生长代谢就可以去除外环境中的磷。而聚磷菌中又存在反硝化聚磷菌，这种菌种可以在聚磷阶段以NO3－为电子受体进行吸磷。

胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）是微生物聚集体重要组成部分，其具有生物吸附作用［18］，而PO43－在碱性环境中易与菌株胞外中的蛋白质、多糖形成沉淀，马放等［10］发现反硝化聚磷菌H16、H19、H24和Xg菌悬液在pH大于8时会出现磷酸盐沉淀物。由图7和图8可以看出B8菌剂种子液有明显的厌氧释磷和好氧（缺氧）除磷的反硝化聚磷菌特征。为了深入研究B8菌的除磷机理，先在温度30℃；培养转速120r／min；pH 6.5条件下培育20h得到高Poly－P含量的B8菌剂种子液，对处理废水量10%的菌液EPS进行提取，再将其投加至待处理废水中，在厌氧－好氧流程和厌氧－缺氧流程处理的16h连续跟踪检测发现处理水中的TP与NO3－—N并无变化，由此可推测出B8菌株对磷的去除能力源于胞内的吸收，而非胞外的生物吸附，而这也符合反硝化聚磷菌的以O2或NO3－为电子受体的摄／放磷原理。

3 结论

1）影响反硝化聚磷菌B8菌剂种子液的多聚磷酸盐颗粒含量的显著培养因素有：时间、温度、摇床转速和pH。在适宜的培养条件（时间15～20h、温度30～32℃、溶解氧相当于70%～88%饱和溶解氧（摇床转速120～140r／min）；pH 6.5～7.0下制得反硝化聚磷菌B8菌剂种子液中的菌株体内的Poly－P的含量较高。将在温度30℃、pH 6.5和摇床培养转速120r／min下培养20h后的B8菌剂种子液以1：10处理实际城市污水，经4h厌氧5h好氧处理除磷率达到94.09%，而经4h厌氧12h缺氧处理除磷率达到89.73%、硝酸盐氮去除率达到53.48%，且出水总磷均降至0.5mg／L以下，达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB 18918—2002）一级A要求。

2）用提取B8菌剂种子液中菌株胞外聚合物进行1∶10处理城市污水，废水中的TP与NO3－—N在处理过程中浓度并无变化，推测B8对磷的去除主要源于菌株胞内的Poly－P的合成，而不是胞外聚合物的生物吸附作用。此对进一步研究反硝化聚磷菌对磷的去除机理有重要的理论意义，但菌株胞内物质等生物学特征还有待于研究。

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