稻草秸秆预处理方法对绿色木霉产纤维素酶的研究

孙宪迅+孙宪猛+韩雪+孙齐英

摘要：以稻草秸秆为原料，采用不同质量分数的磷酸、氨水、磷酸与氨水联合浸泡处理等方法对稻草桔秆进行预处理，预处理后稻草用于纤维素酶固态发酵。以羧甲基纤维素酶（CMC）酶活和滤纸酶（FPA）酶活为指标，比较不同预处理方法对绿色木霉（Trichoderma viride）固态发酵产纤维素酶的影响。研究结果表明，磷酸与氨水联合预处理秸秆最有利于绿色木霉固态发酵产纤维素酶，羧甲基纤维素酶（CMC）酶活和滤纸酶（FPA）酶活分别是未处理的283.25%和174.38%。

关键词：稻草秸秆；绿色木霉（Trichoderma viride）；固态发酵；纤维素酶

中图分类号：TS254.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）18-4387-03

近年来，由于化石能源枯竭和大量使用带来的温室效应，可再生资源的开发利用日益受到人们重视[1，2]。稻草是一种非常丰富的可再生能源，利用稻草秸秆生产纤维素酶，对纤维乙醇的生产有重要的现实意义[3，4]。稻草秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其中木质素的包覆作用及纤维素结晶致密结构使各种菌株产酶活力低，成本高。采用物理、化学和生物方法对稻草进行预处理，尽量除去木质素，破坏纤维素的晶体结构，提高纤维素酶的活力[5]。通常的预处理方法往往以预处理产糖或者后续酶解率为考核指标，而预处理方法对微生物利用产酶的研究报道很少[6-11]。本研究以绿色木霉（Trichoderma viride）为出发菌株，研究几种稻草预处理方法对菌株产纤维素酶效果的影响进行了比较。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种为绿色木霉，实验室保藏；稻草秸秆取自武汉汉阳郊区。

1.2 培养基

种子培养基为PDA培养基；发酵培养基[12]：稻草∶麸皮=3∶2，固液比为1∶2，Mandrels溶液与固体比=2∶1；Mandrels营养液：KH2PO4 2 g，（NH4）2SO4 1.4 g，尿素0.3 g，MgSO4 7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，FeSO4 7H2O 5 mg，MnSO4 H2O 1.56 mg，ZnSO4 1.4 mg，CoCl2 0.2 mg，水1 L。

1.3 试验方法

1.3.1 木霉发酵产酶及测试[13] 在250 mL三角瓶中装入5%固体培养基（稻草15 g，麸皮10 g，Mandrels溶液50 mL）按2%接入种子液，于37 ℃发酵72 h，每隔12 h摇匀一次固体培养基，发酵结束后，室温自然风干即为纤维素酶干曲。粗酶液的制备：取纤维素酶干曲5 g加200 mL去离子水溶解，纱布过滤后3 000 r/min离心，再适当稀释即为待测酶液。

1.3.2 酶活测定 羧甲基纤维素钠酶活（CMC）单位定义：在40 ℃ pH 4.8条件下，每l g纤维素酶干曲在1 min内水解CMC生成l μmol葡萄糖的酶量，为一个纤维素酶（CMC酶）活力单位（以U表示）； 滤纸酶活（FPA）单位定义：在40 ℃ pH 4.8条件下，每 l g纤维素酶干曲在l h内水解新华滤纸，生成l μmol葡萄糖的酶量，为一个纤维素酶滤纸酶活单位（以U表示）。

1）羧甲基纤维素钠酶活（CMC）测定。吸取0.5 mL粗酶稀释液于试管中，加入1.5 mL 1%CMC-柠檬酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 4.8），于40 ℃水浴反应30 min，立即加入2.5 mL DNS煮沸灭活，测定还原糖含量。

2）滤纸酶活（FPA）测定。吸取0.5 mL粗酶稀释液于试管中，加入1.5 mL柠檬酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 4.8），混匀后将1条1 cm×6 cm的滤纸条卷成小卷放入其中，于40 ℃水浴反应60 min，立即加入2.5 mL DNS煮沸灭活，测定还原糖含量。

1.3.3 试验设计

1）稻草粉碎度对绿色木霉发酵的影响。稻草先剪成5 cm左右，再用气流式超微高速粉碎机粉碎后，分别用100、80、60、40、20目的筛子过筛分级，各称取适量稻草粉作为惟一碳源，配置培养基，比较不同粉碎度对绿色木霉固态发酵产纤维素酶的影响。

2）浓磷酸预处理对绿色木霉发酵的影响。将稻草秸秆粉碎，过60目筛，按稻草与不同质量分数的浓磷酸按固液比（m/V，g∶mL，下同）1∶8在50 ℃处理时间1.0 h，预处理结束后，过滤，滤饼烘干至恒重备用。称取适量预处理后稻草粉作为惟一碳源，配置培养基，比较不同质量分数浓磷酸预处理对绿色木霉产纤维素酶固态发酵的影响，以不处理的为对照（CK）。

3）氨水预处理对绿色木霉发酵的影响。将稻草秸秆粉碎，过60目筛，稻草与不同浓度氨水按固液比1∶8室温下预处理35 h，过滤，滤饼烘干至恒重备用。称取适量预处理后稻草粉作为惟一碳源，配置培养基，比较不同浓度氨水预处理对绿色木霉产纤维素酶固态发酵的影响，以不处理的为对照（CK）。

4）氨水与浓磷酸结合预处理。①将过60目筛的稻草秸秆粉末，先用15%氨水按固液比1∶6室温下浸泡20 h，过滤，风干；再用40%浓磷酸按1∶10，温度50 ℃处理时间30 min，过滤，滤饼烘干至恒重备用；②将过60目筛的稻草秸秆粉末，先用40%浓磷酸按固液比1∶10，温度50 ℃处理时间30 min，过滤，风干；再用15%氨水按固液比1∶6，室温下浸泡20 h，过滤，滤饼烘干至恒重备用，后续酶活测定同氨水处理。

2 结果与分析

2.1 稻草粉碎度对绿色木霉产酶的影响

不同粉碎度的稻草粉作为碳源，绿色木霉表现出不同的产纤维素酶能力（表1）。由表1可以看出，稻草秸秆粉碎后的CMC酶活和滤纸酶活比未处理的对照都高，而且随着粉碎度的增加，产酶能力逐渐提高。从20目升高到60目时，酶活升高较快。当粉碎度达到60目时，产酶能力较高。当从60目升高到100目时，产酶增加不多。目数越大，预处理成本越大。从节约成本和能源的角度考虑，以选择粉碎度60目为宜。

2.2 磷酸预处理对绿色木霉产酶的影响

以对照组的CMC酶和FPA酶活为100%，计算采用不同质量分数磷酸预处理后各组的相对酶活（表2）。磷酸预处理后的稻草粉过滤烘干直接作为绿色木霉的碳源进行纤维素酶发酵，所产的酶活比未处理的对照都低。磷酸预处理稻草粉可以裂解木质素的结构，降解部分半纤维素，破坏纤维素的晶体结构。稻草经磷酸预处理产生呋喃、酚醛以及其他有机酸等物质，而其中一些物质不但对微生物生长具有抑制作用，而且不利于菌株的产酶。磷酸是不挥发性酸，残留的磷酸抑制菌株的生长与产酶。磷酸预处理后的稻草烘干直接发酵CMC酶活和FPA酶活明显降低。

2.3 氨水预处理对绿色木霉产酶的影响

以对照组的CMC酶和滤纸酶活为100%，计算采用不同浓度氨水预浸泡的各组的相对酶活（表3）。氨水预处理后的稻草粉过滤烘干直接作为绿色木霉的碳源进行纤维素酶发酵，所产的酶活比对照未处理的都低。氨水主要是破坏稻草粉的木质素的结构，降解部分半纤维素。残留的木质素小分子物质对纤维素酶活有影响，故所测的纤维素酶活较低。残余的氨水易挥发，又能被绿色木霉当氮源加以利用，纤维素被氨水浸泡预处理后直接发酵产纤维素酶比磷酸预处理效果好。

2.4 磷酸氨水联合预处理结果

稻草粉先用15%氨水浸泡，再用浓磷酸预处理，过滤、烘干的稻草粉作为绿色木霉的碳源进行纤维素酶发酵，所测的CMC酶活和FPA酶活与对照的比较，都明显降低，但比单独的磷酸处理降低要少。这与氨水浸泡带走部分木质素，后用磷酸处理产生的副产物较少有关，主要是残留的磷酸对绿色木霉产酶影响。稻草粉先用磷酸处理，再用氨水浸泡，过滤、烘干的稻草粉作为绿色木霉的碳源进行纤维素酶发酵，所测的CMC酶活和滤纸酶活分别是未处理的283.25%和174.38%。其原因可能是磷酸预处理破坏大部分木质素，纤维素的晶体结构被破坏。在此过程中产生的一些副产物如呋喃、酚醛以及其他有机酸等，被后续的氨水稀释带走。磷酸处理中残留的磷酸被氨水中和，被带走或者生成磷酸盐被微生物吸收利用。氨水在后处理过程中，对木质素也有部分溶解作用，使稻草中的木质素处理更加完全。而氨水易挥发残留少，即使在稻草中也能被微生物作为氮源吸收利用，所产生的CMC酶活和FPA酶活明显提高。

3 小结与讨论

粉碎度对绿色木霉利用稻草作为惟一的碳源产纤维素酶有帮助。粉碎度越大，同样条件下产纤维素酶酶活越高，考虑到生产成本，粉碎到60目就满足工艺条件。取机械粉碎后的稻草过60目筛，先用40%的磷酸预处理，过滤晾干后再用10%的氨水浸泡，预处理的稻草粉纤维素酶发酵，所测的CMC酶活和滤纸酶活分别是未处理的283.25%和174.38%。

目前采用酸碱预处理木质纤维素原料是常用的方法，但是原料预处理后，须用大量的水进行洗涤和脱毒处理。既产生大量的废水，污染环境，又会去除部分营养成分，导致必要营养素缺乏，需要在后续工艺中添加。采用先磷酸处理后氨水浸泡的方法，不需要进行洗涤和脱毒处理，微生物能利用生产纤维素酶。本工艺首先利用磷酸部分脱除稻草粉中木质素和破坏纤维素的晶体结构，再用氨水浸泡，氨水既中和残留的磷酸，又部分去除木质素，使得微生物能利用纤维素产酶。操作在常温常压下进行，对设备要求和节能方面具有优势，采用本工艺可以降低生产成本和能耗。

参考文献：

[1] GOH C S， TAN K T， LEE K T， et al. Bio-ethanol from lignocellulose： Status， perspectives and challenges in Malaysia[J]. Bioresour Technol，2010，101（13）：4834-4841.

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[3] KIM J W，KIM K S，Lee J S，et al. Two-stage pretreatment of rice straw using aqueous ammonia and dilute acid[J]. Bioresour Technol，2011，102（19）： 8992-8999.

[4] KO J K，BAK J S，JUNG M W，et al. Ethanol production from rice straw using optimized aqueous-ammonia soaking pretreatment and simultaneous sacchari cation and fermentation processes[J]. Bioresour Technol， 2009， 100（19）： 4374-4380.

[5] KUMAR P，BARRETT D M，DELWICHE M J，et al.Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for ef cient hydrolysis and biofuel production[J]. Industrial&Engineering Chemistry Research， 2009， 48（8）：3713-3729.

[6] 侯丽丽，车程川，杨 革.不同预处理方法对秸秆稻草固态发酵产纤维素酶的影响[J].曲阜师范大学学报，2010，36（1）：100-103.

[7] 杨培周，姜绍通，潘丽军，等.超声波/稀H2SO4预处理对玉米秸秆液体发酵产纤维素酶的影响[J].安徽农业科学，2010，38（1）：520-521，537.

[8] 吕文静，胡佑彪，姚海龙，等.稻草秸秆预处理方法对烟曲霉产纤维素酶的影响[J].生物学杂志，2010，27（6）：53-56.

[9] 王欲晓，周琳琳.里氏木酶利用预处理小麦秆生产纤维素酶的应用研究[J].广州化工，2012，40（4）：29-33.

[10] 许宪松，周玉杰，张建安，等.微波预处理稻壳对纤维素酶固态发酵的影响[J].可再生能源，2006（4）：21-25.

[11] 王菁莎，王 颉，周家楠，等.里氏木酶LW1固态发酵纤维素酶条件的研究[J].生物学杂志，2006，23（3）：32-36.

[12] 邱雁临，孙宪迅，曾 莹.发酵秸秆生产纤维素酶工艺条件的研究[J].粮油食品科技，2004，12（4）：4-6.

[13] 邱雁临，孙宪迅，蔡 俊，等.纤维素酶耐高温高产菌株的选育[J].中国酿造，2004（2）：15-19.

2.2 磷酸预处理对绿色木霉产酶的影响

以对照组的CMC酶和FPA酶活为100%，计算采用不同质量分数磷酸预处理后各组的相对酶活（表2）。磷酸预处理后的稻草粉过滤烘干直接作为绿色木霉的碳源进行纤维素酶发酵，所产的酶活比未处理的对照都低。磷酸预处理稻草粉可以裂解木质素的结构，降解部分半纤维素，破坏纤维素的晶体结构。稻草经磷酸预处理产生呋喃、酚醛以及其他有机酸等物质，而其中一些物质不但对微生物生长具有抑制作用，而且不利于菌株的产酶。磷酸是不挥发性酸，残留的磷酸抑制菌株的生长与产酶。磷酸预处理后的稻草烘干直接发酵CMC酶活和FPA酶活明显降低。

2.3 氨水预处理对绿色木霉产酶的影响

以对照组的CMC酶和滤纸酶活为100%，计算采用不同浓度氨水预浸泡的各组的相对酶活（表3）。氨水预处理后的稻草粉过滤烘干直接作为绿色木霉的碳源进行纤维素酶发酵，所产的酶活比对照未处理的都低。氨水主要是破坏稻草粉的木质素的结构，降解部分半纤维素。残留的木质素小分子物质对纤维素酶活有影响，故所测的纤维素酶活较低。残余的氨水易挥发，又能被绿色木霉当氮源加以利用，纤维素被氨水浸泡预处理后直接发酵产纤维素酶比磷酸预处理效果好。

2.4 磷酸氨水联合预处理结果

稻草粉先用15%氨水浸泡，再用浓磷酸预处理，过滤、烘干的稻草粉作为绿色木霉的碳源进行纤维素酶发酵，所测的CMC酶活和FPA酶活与对照的比较，都明显降低，但比单独的磷酸处理降低要少。这与氨水浸泡带走部分木质素，后用磷酸处理产生的副产物较少有关，主要是残留的磷酸对绿色木霉产酶影响。稻草粉先用磷酸处理，再用氨水浸泡，过滤、烘干的稻草粉作为绿色木霉的碳源进行纤维素酶发酵，所测的CMC酶活和滤纸酶活分别是未处理的283.25%和174.38%。其原因可能是磷酸预处理破坏大部分木质素，纤维素的晶体结构被破坏。在此过程中产生的一些副产物如呋喃、酚醛以及其他有机酸等，被后续的氨水稀释带走。磷酸处理中残留的磷酸被氨水中和，被带走或者生成磷酸盐被微生物吸收利用。氨水在后处理过程中，对木质素也有部分溶解作用，使稻草中的木质素处理更加完全。而氨水易挥发残留少，即使在稻草中也能被微生物作为氮源吸收利用，所产生的CMC酶活和FPA酶活明显提高。

3 小结与讨论

粉碎度对绿色木霉利用稻草作为惟一的碳源产纤维素酶有帮助。粉碎度越大，同样条件下产纤维素酶酶活越高，考虑到生产成本，粉碎到60目就满足工艺条件。取机械粉碎后的稻草过60目筛，先用40%的磷酸预处理，过滤晾干后再用10%的氨水浸泡，预处理的稻草粉纤维素酶发酵，所测的CMC酶活和滤纸酶活分别是未处理的283.25%和174.38%。

目前采用酸碱预处理木质纤维素原料是常用的方法，但是原料预处理后，须用大量的水进行洗涤和脱毒处理。既产生大量的废水，污染环境，又会去除部分营养成分，导致必要营养素缺乏，需要在后续工艺中添加。采用先磷酸处理后氨水浸泡的方法，不需要进行洗涤和脱毒处理，微生物能利用生产纤维素酶。本工艺首先利用磷酸部分脱除稻草粉中木质素和破坏纤维素的晶体结构，再用氨水浸泡，氨水既中和残留的磷酸，又部分去除木质素，使得微生物能利用纤维素产酶。操作在常温常压下进行，对设备要求和节能方面具有优势，采用本工艺可以降低生产成本和能耗。

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2.2 磷酸预处理对绿色木霉产酶的影响

以对照组的CMC酶和FPA酶活为100%，计算采用不同质量分数磷酸预处理后各组的相对酶活（表2）。磷酸预处理后的稻草粉过滤烘干直接作为绿色木霉的碳源进行纤维素酶发酵，所产的酶活比未处理的对照都低。磷酸预处理稻草粉可以裂解木质素的结构，降解部分半纤维素，破坏纤维素的晶体结构。稻草经磷酸预处理产生呋喃、酚醛以及其他有机酸等物质，而其中一些物质不但对微生物生长具有抑制作用，而且不利于菌株的产酶。磷酸是不挥发性酸，残留的磷酸抑制菌株的生长与产酶。磷酸预处理后的稻草烘干直接发酵CMC酶活和FPA酶活明显降低。

2.3 氨水预处理对绿色木霉产酶的影响

以对照组的CMC酶和滤纸酶活为100%，计算采用不同浓度氨水预浸泡的各组的相对酶活（表3）。氨水预处理后的稻草粉过滤烘干直接作为绿色木霉的碳源进行纤维素酶发酵，所产的酶活比对照未处理的都低。氨水主要是破坏稻草粉的木质素的结构，降解部分半纤维素。残留的木质素小分子物质对纤维素酶活有影响，故所测的纤维素酶活较低。残余的氨水易挥发，又能被绿色木霉当氮源加以利用，纤维素被氨水浸泡预处理后直接发酵产纤维素酶比磷酸预处理效果好。

2.4 磷酸氨水联合预处理结果

稻草粉先用15%氨水浸泡，再用浓磷酸预处理，过滤、烘干的稻草粉作为绿色木霉的碳源进行纤维素酶发酵，所测的CMC酶活和FPA酶活与对照的比较，都明显降低，但比单独的磷酸处理降低要少。这与氨水浸泡带走部分木质素，后用磷酸处理产生的副产物较少有关，主要是残留的磷酸对绿色木霉产酶影响。稻草粉先用磷酸处理，再用氨水浸泡，过滤、烘干的稻草粉作为绿色木霉的碳源进行纤维素酶发酵，所测的CMC酶活和滤纸酶活分别是未处理的283.25%和174.38%。其原因可能是磷酸预处理破坏大部分木质素，纤维素的晶体结构被破坏。在此过程中产生的一些副产物如呋喃、酚醛以及其他有机酸等，被后续的氨水稀释带走。磷酸处理中残留的磷酸被氨水中和，被带走或者生成磷酸盐被微生物吸收利用。氨水在后处理过程中，对木质素也有部分溶解作用，使稻草中的木质素处理更加完全。而氨水易挥发残留少，即使在稻草中也能被微生物作为氮源吸收利用，所产生的CMC酶活和FPA酶活明显提高。

3 小结与讨论

粉碎度对绿色木霉利用稻草作为惟一的碳源产纤维素酶有帮助。粉碎度越大，同样条件下产纤维素酶酶活越高，考虑到生产成本，粉碎到60目就满足工艺条件。取机械粉碎后的稻草过60目筛，先用40%的磷酸预处理，过滤晾干后再用10%的氨水浸泡，预处理的稻草粉纤维素酶发酵，所测的CMC酶活和滤纸酶活分别是未处理的283.25%和174.38%。

目前采用酸碱预处理木质纤维素原料是常用的方法，但是原料预处理后，须用大量的水进行洗涤和脱毒处理。既产生大量的废水，污染环境，又会去除部分营养成分，导致必要营养素缺乏，需要在后续工艺中添加。采用先磷酸处理后氨水浸泡的方法，不需要进行洗涤和脱毒处理，微生物能利用生产纤维素酶。本工艺首先利用磷酸部分脱除稻草粉中木质素和破坏纤维素的晶体结构，再用氨水浸泡，氨水既中和残留的磷酸，又部分去除木质素，使得微生物能利用纤维素产酶。操作在常温常压下进行，对设备要求和节能方面具有优势，采用本工艺可以降低生产成本和能耗。

参考文献：

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[7] 杨培周，姜绍通，潘丽军，等.超声波/稀H2SO4预处理对玉米秸秆液体发酵产纤维素酶的影响[J].安徽农业科学，2010，38（1）：520-521，537.

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