草莓镶脉病毒粒子提取及电镜观察

肖文斐+裘劼人+柳爱春等

摘要：从受感染的草莓（Fragaria sp）植株中提取了草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）粒子并对其进行了电镜观察。用CTAB法从草莓叶片中提取总核酸，设计SVBV外壳蛋白基因特异性引物，利用PCR方法对杭州地区的草莓镶脉病毒感染情况进行检测。检测结果表明，在杭州地区大田种植的草莓中存在SVBV感染现象。从4株受感染草莓植株中分离克隆了SVBV的CP基因片段并测序；序列比较分析发现它们与已报道的美国SVBV分离物的CP基因（序列号NC_001725）核苷酸同源性为91%。利用差速离心法从上述草莓植株的叶片中提纯SVBV病毒，在透射电镜下观察到SVBV病毒粒子呈球形，直径约为40～55 nm。

关键词：草莓镶脉病毒（SVBV）；PCR检测；病毒提取；电镜观察

中图分类号：S432.4+1；S431.192 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）18-4313-03

草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，简称SVBV）在世界上分布广泛，对草莓（Fragaria sp）危害较为严重，也是中国草莓生产的主要病毒病害之一，在吉林、河南、河北、辽宁、山东等地区均有发生[1，2]。SVBV在分类上属花椰菜花叶病毒（Caulimoviruses，CaMV），是一种双链DNA病毒，以半持久性方式通过蚜虫或嫁接传播。SVBV侵染可削弱草莓生长势，降低产量及品质；而与其他病毒或细菌、真菌复合侵染则会造成严重病害发生，给草莓的生产带来严重损失[3，4]。

Petrzik等[5]1998年测定了SVBV美国加州分离物的全基因组序列，并在此基础上发展了该病毒的PCR检测。目前，国内外众多研究者已利用PCR方法检测了不同的SVBV分离物[6-12]。研究表明，由于SVBV来源、地域不同，基因组存在着分子变异，分子检测方法也有所不同。其中，外壳蛋白在SVBV中的保守性较好，不同地区中SVBV不同分离物外壳蛋白基因间分子变异较小，通常作为PCR检测的首选区域。

虽然已对SVBV建立了高效、灵敏的PCR检测方法。但在开展大规模病毒调查时，血清学检测手段则更加简单和实用。目前SVBV仍无商品化的抗血清检测试剂，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测较难实施。本研究用超速离心法从感染草莓镶脉病毒（SVBV）的草莓叶片中提纯SVBV病毒，为进一步制备SVBV抗血清和单克隆抗体提供有效的抗原基础。

1 材料与方法

1.1 材料

从浙江杭州地区采集带疑似病症和无症状草莓植株，盆栽种植于大棚，选取新鲜草莓叶片作为试验材料。草莓品种为红颊。

1.2 方法

1.2.1 病毒检测

1）草莓叶片总核酸提取 参照文献[11]采用改进的CTAB法抽提草莓总核酸。将少量草莓叶片在液氮中迅速研碎，取约50 mg粉末加入盛有500 μL CTAB提取缓冲液（2% CTAB；100 mmol Tris， pH 8.0；20 mmol EDTA；1.4 mmol NaCl；使用前加入2%β-巯基乙醇）的1.5 mL Eppendorf 管中，65 ℃水浴20 min。用等体积氯仿/异戊醇（24︰1）抽提2次，上清液中加入1/10体积的3 mmol/L NaAc（pH 5.2）、2.5倍体积无水乙醇，反复颠倒数次，取沉淀。70%乙醇洗涤沉淀2次，放置在超净工作台上吹干，加入50 μL DEPC水溶解。用紫外分光光度计测定其OD260 nm。

2）PCR反应体系 根据GenBank中的SVBV基因组序列，参照文献[12]设计同源引物B1F（5′-GAATGGGACAATGAAATGAG-3′）和B1R（5′- GTGAGGAGAACTTAGGACA-3′）。所用引物由上海英骏生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系总体积为20.0 μL，其中包括模板DNA 1.0 μL、引物（10 μmol/L）0.5 μL， Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.2 μL，dNTP（10 mmol/L） 0.4 μL，10×PCR Buffer（含 25 mmol/L MgCl2） 2.0 μL，ddH2O 13.4 μL。所用试剂购于宝生物（大连）生物工程有限公司。扩增程序为： 94 ℃ 预变性3 min；94 ℃变性1 min，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

3）目的片段的克隆及测序 利用琼脂糖凝胶回收试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司产品]从凝胶中回收目的片段，与pUC19-T Easy载体连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经蓝白斑筛选，挑取白色菌落培养，提取质粒，通过PCR鉴定阳性克隆。测序工作委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行。获得的序列用BLAST在GenBank中进行检索分析，利用软件CLUSTAL 1.83进行多序列比对。

1.2.2 病毒纯化 参照文献[13]中花椰菜花叶病毒的提取方法进行操作。收集100～200 g新鲜草莓叶片，置于200 mL 0.5 μmol/L 的磷酸钠（pH 7.2）溶液中磨成匀浆，每100 g匀浆加入0.75 g亚硫酸钠，冰上操作；将匀浆倒入烧杯中，每100 mL匀浆加入6 g尿素和25 mL Triton X-100， 4 ℃搅拌过夜；4 ℃ 4 000 g离心10 min；轻柔地用4层纱布过滤，将液体倒入离心管，4 ℃ 7 000 g离心2 h；倒弃上清液，每管用 1mL灭菌去离子水重悬沉淀1～2 h；收集重悬液，用微型离心机离心2次，去除不溶颗粒；将上清液用去离子水稀释到一定体积，13 600 g 4 ℃离心1 h；用0.01 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）重悬病毒粒子，4 ℃或-20 ℃保存。紫外分光光度计测定其OD260 nm。

1.2.3 电镜观察 将病毒提纯液（5 uL）置于2%磷钨酸溶液（pH 6.8）中负染约30 min，用JEM-1230型透射电镜进行观察拍照。

2 结果与分析

2.1 草莓总核酸情况

采用改进的CTAB法抽提的草莓叶片总核酸沉淀呈乳白色，易溶于水，不黏稠，多糖含量较少。经紫外分光光度计测定，核酸浓度为120～400 ng/uL，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0之间。经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，其DNA条带清晰，完整性较好（图1）。

2.2 PCR产物电泳分析

以提取的草莓总核酸为模板，用引物（B1F、B1R）进行PCR反应，扩增获得了与预期片段（574 bp）大小一致的扩增产物。2012年从浙江杭州地区采集可疑症状样品和部分无症状样品共48份，共检出带SVBV阳性材料24份。其中，多代苗中草莓病毒侵染率约为42.8%，而一代苗和二代苗中病毒侵染率低于10.0%；田间曾感染过真菌或细菌病害的草莓病毒侵染率较高，最高的为82.5%，未明显发病区域的病毒侵染率在10%～28%之间。

2.3 基因片段序列测定

选取来源于不同植株的4个阳性克隆进行测序，测序结果表明，4个克隆片段的序列完全一致，序列总长574 bp，在NCBI网站（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov）上进行Blast分析，发现该序列与GenBank中的已知SVBV序列同源。与中国郑州分离物（序列号AY862389）核苷酸同源性最高，为95%；与沈阳分离物（序列号AY955374）同源性为94%，而与美国分离物（序列号NC_001725）同源性为91%。而该区段对应的蛋白质序列与上述3个分离物同源性分别为99%、98%和98%。将测序结果提交GenBank获得序列号KJ774105，同时将此次采集的SVBV分离物定为杭州分离物。

2.4 病毒纯化情况

病毒具有特有的紫外吸收峰，通过紫外分光光度计可以测定推算病毒浓度[14]。采用微量分光光度计测量SVBV病毒提纯液的紫外吸收光谱，发现其OD260 nm为1.454，OD260 nm/OD280 nm为1.41。资料显示[13]，花椰菜花叶病毒消光系数E（0.1%、1 cm、260 nm）为7，根据公式，病毒浓度（mg/mL）=OD260 nm×稀释倍数/E，推算出提纯的病毒浓度约为0.2 mg/mL。

2.5 病毒粒子的形态

病毒提纯液用2%磷钨酸溶液负染后，在透射电镜下可观察到球形的病毒粒子，直径约为40～55 nm，粒子中心可见清晰核心（图2）。该病毒粒子形态与已报道的花椰菜花叶病毒的病毒粒子非常吻合。而对照健康杨叶未观察到类似颗粒。

3 小结与讨论

SVBV是我国草莓的主要病毒病害之一，在吉林、河南、河北、辽宁、山东等地区均有发生，但经检索，未发现在浙江草莓种植区发生该病的报道。本研究发现，杭州地区栽培草莓中也存在SVBV感染。其中，多代苗的侵染率高于低代苗，而炭疽病等真菌感染、蚜虫数量多也会增加SVBV感染率。因此，田间草莓镶脉病毒的防治首先要选取无病毒低代苗作为种苗，同时要注意蚜虫和其他病害的防治。

前人研究表明[6，11，15]，SVBV存在株系分化现象，不同基因型在不同生态地理条件下核酸序列存在变化，即使比较保守的CP基因也有核苷酸的改变。本研究通过序列分析，发现SVBV杭州分离物与郑州分离物同源性最高，与沈阳分离物次之，与美国分离物同源性最低。由此推测，不同株系间基因序列的变异可能是地域差异造成的。因此，在病毒PCR检测的实践中，特异引物的选择设计尤其重要，同时参考几对引物的扩增结果有助于假阴性的识别。

SVBV属花椰菜花叶病毒。在本研究中，参考改进的花椰菜花叶病毒提纯方法[13]，在受侵染的草莓叶片中提纯得到了SVBV病毒。目前，还未有商业化的SVBV抗体研制成功，限制了该病毒的血清学检测。江彤等[16，17]采用通过原核表达获得目的蛋白再免疫兔子的方式制备了SVBV的抗血清。由于利用提纯病毒制备的抗血清本底低、效价高，通过商业途径销售的抗血清多倾向于利用提纯病毒制备。后期研究可用提纯的病毒粒子研究制备抗血清，为该病毒的血清学检测奠定基础。

参考文献：

[1] 王国平，刘福昌，国际翔.我国草莓主栽区病毒种类的鉴定[J].植物病理学报，1991，21（1）：9-14.

[2] HONETSLEGROVA J，MRAZ I，SPAK J.Detection and isolation of strawberry vein banding virus in the Czech Republic[J].Acta Hortie，1995，385：29-32.

[3] MORRIS T J，MULLIN R H，SCHLEGEL D E.Isolation of a caulimovirus from strawberry tissue infected with strawberry vei banding virus[J]. Phytopathology，1980，70：156-160.

[4] MASS J L.草莓病虫害概论[M].第二版.张运涛，张国珍，译.北京：中国农业出版社，2012.

[5] PETRZIK K，BENES V，MRAZ I，et al.Strawberry vein banding vires-definitive member of the genus Caulimovirus[J].Vires Genes，1998，16（3）：303-305.

[6] MRAZ I，PETRZIK K，SIP M，et al.Variability in coat protein homology among American and European sources of strawberry vein binding virus[J]. Plant Disease，1998，82：544-546.

[7] 肖 敏，张志宏.草莓镶脉病毒研究进展[J].辽宁农业科学，2005（4）：36-38.

[8] ROBERT R M，IOANNIS E T.Characterization and recent advances in detection of strawberry viruses[J]. Plant Disease，2006， 90（4）：384-396.

[9] 陈晓军，王敬东，马洪爱，等.草莓镶脉病毒检测方法研究[J].北方园艺，2010 （22）：123-125.

[10] 隋 春，吴禄平，张志宏.利用PCR技术检测草莓镶脉病毒[J].园艺学报，2003，30（1）：82-84.

[11] 肖 敏，张志宏，代红艳，等.PCR检测草莓镶脉病毒的稳定性研究[J].果树学报，2005，22（5）：483-487.

[12] 周厚成，李思源，何水涛，等.草莓镶脉病毒的PCR检测及特异片段的序列分析[J].果树学报，2005，22（3）：286-288.

[13] HULL R，SHEPHERD R J.Cauliflower mosaic virus： An improved purification procedure and some properties of the virus particles[J].Journal of general virology，1976，31：93-100.

[14] 章绍延，王健华，谭老喜，等.一辣椒环斑病毒提纯及抗血清制备[J].热带作物学报，2013，34（3）：534-537.

[15] 洪 健，李德葆，周雪平.植物病毒分类图谱[M].北京：科学出版社，2001.

[16] 江 彤，杨友志，丁 菲，等.草莓镶脉病毒外壳蛋白的原核表达及多抗血清制备[J].南京农业大学学报，2012，35（6）：30-34.

[17] 江 彤，谢朝阳，丁 菲，等.草莓镶脉病毒ORF Ⅵ基因的原核表达与抗血清制备[J].植物保护学报，2013，40（6）：511-516.

1.2.3 电镜观察 将病毒提纯液（5 uL）置于2%磷钨酸溶液（pH 6.8）中负染约30 min，用JEM-1230型透射电镜进行观察拍照。

2 结果与分析

2.1 草莓总核酸情况

采用改进的CTAB法抽提的草莓叶片总核酸沉淀呈乳白色，易溶于水，不黏稠，多糖含量较少。经紫外分光光度计测定，核酸浓度为120～400 ng/uL，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0之间。经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，其DNA条带清晰，完整性较好（图1）。

2.2 PCR产物电泳分析

以提取的草莓总核酸为模板，用引物（B1F、B1R）进行PCR反应，扩增获得了与预期片段（574 bp）大小一致的扩增产物。2012年从浙江杭州地区采集可疑症状样品和部分无症状样品共48份，共检出带SVBV阳性材料24份。其中，多代苗中草莓病毒侵染率约为42.8%，而一代苗和二代苗中病毒侵染率低于10.0%；田间曾感染过真菌或细菌病害的草莓病毒侵染率较高，最高的为82.5%，未明显发病区域的病毒侵染率在10%～28%之间。

2.3 基因片段序列测定

选取来源于不同植株的4个阳性克隆进行测序，测序结果表明，4个克隆片段的序列完全一致，序列总长574 bp，在NCBI网站（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov）上进行Blast分析，发现该序列与GenBank中的已知SVBV序列同源。与中国郑州分离物（序列号AY862389）核苷酸同源性最高，为95%；与沈阳分离物（序列号AY955374）同源性为94%，而与美国分离物（序列号NC_001725）同源性为91%。而该区段对应的蛋白质序列与上述3个分离物同源性分别为99%、98%和98%。将测序结果提交GenBank获得序列号KJ774105，同时将此次采集的SVBV分离物定为杭州分离物。

2.4 病毒纯化情况

病毒具有特有的紫外吸收峰，通过紫外分光光度计可以测定推算病毒浓度[14]。采用微量分光光度计测量SVBV病毒提纯液的紫外吸收光谱，发现其OD260 nm为1.454，OD260 nm/OD280 nm为1.41。资料显示[13]，花椰菜花叶病毒消光系数E（0.1%、1 cm、260 nm）为7，根据公式，病毒浓度（mg/mL）=OD260 nm×稀释倍数/E，推算出提纯的病毒浓度约为0.2 mg/mL。

2.5 病毒粒子的形态

病毒提纯液用2%磷钨酸溶液负染后，在透射电镜下可观察到球形的病毒粒子，直径约为40～55 nm，粒子中心可见清晰核心（图2）。该病毒粒子形态与已报道的花椰菜花叶病毒的病毒粒子非常吻合。而对照健康杨叶未观察到类似颗粒。

3 小结与讨论

SVBV是我国草莓的主要病毒病害之一，在吉林、河南、河北、辽宁、山东等地区均有发生，但经检索，未发现在浙江草莓种植区发生该病的报道。本研究发现，杭州地区栽培草莓中也存在SVBV感染。其中，多代苗的侵染率高于低代苗，而炭疽病等真菌感染、蚜虫数量多也会增加SVBV感染率。因此，田间草莓镶脉病毒的防治首先要选取无病毒低代苗作为种苗，同时要注意蚜虫和其他病害的防治。

前人研究表明[6，11，15]，SVBV存在株系分化现象，不同基因型在不同生态地理条件下核酸序列存在变化，即使比较保守的CP基因也有核苷酸的改变。本研究通过序列分析，发现SVBV杭州分离物与郑州分离物同源性最高，与沈阳分离物次之，与美国分离物同源性最低。由此推测，不同株系间基因序列的变异可能是地域差异造成的。因此，在病毒PCR检测的实践中，特异引物的选择设计尤其重要，同时参考几对引物的扩增结果有助于假阴性的识别。

SVBV属花椰菜花叶病毒。在本研究中，参考改进的花椰菜花叶病毒提纯方法[13]，在受侵染的草莓叶片中提纯得到了SVBV病毒。目前，还未有商业化的SVBV抗体研制成功，限制了该病毒的血清学检测。江彤等[16，17]采用通过原核表达获得目的蛋白再免疫兔子的方式制备了SVBV的抗血清。由于利用提纯病毒制备的抗血清本底低、效价高，通过商业途径销售的抗血清多倾向于利用提纯病毒制备。后期研究可用提纯的病毒粒子研究制备抗血清，为该病毒的血清学检测奠定基础。

参考文献：

[1] 王国平，刘福昌，国际翔.我国草莓主栽区病毒种类的鉴定[J].植物病理学报，1991，21（1）：9-14.

[2] HONETSLEGROVA J，MRAZ I，SPAK J.Detection and isolation of strawberry vein banding virus in the Czech Republic[J].Acta Hortie，1995，385：29-32.

[3] MORRIS T J，MULLIN R H，SCHLEGEL D E.Isolation of a caulimovirus from strawberry tissue infected with strawberry vei banding virus[J]. Phytopathology，1980，70：156-160.

[4] MASS J L.草莓病虫害概论[M].第二版.张运涛，张国珍，译.北京：中国农业出版社，2012.

[5] PETRZIK K，BENES V，MRAZ I，et al.Strawberry vein banding vires-definitive member of the genus Caulimovirus[J].Vires Genes，1998，16（3）：303-305.

[6] MRAZ I，PETRZIK K，SIP M，et al.Variability in coat protein homology among American and European sources of strawberry vein binding virus[J]. Plant Disease，1998，82：544-546.

[7] 肖 敏，张志宏.草莓镶脉病毒研究进展[J].辽宁农业科学，2005（4）：36-38.

[8] ROBERT R M，IOANNIS E T.Characterization and recent advances in detection of strawberry viruses[J]. Plant Disease，2006， 90（4）：384-396.

[9] 陈晓军，王敬东，马洪爱，等.草莓镶脉病毒检测方法研究[J].北方园艺，2010 （22）：123-125.

[10] 隋 春，吴禄平，张志宏.利用PCR技术检测草莓镶脉病毒[J].园艺学报，2003，30（1）：82-84.

[11] 肖 敏，张志宏，代红艳，等.PCR检测草莓镶脉病毒的稳定性研究[J].果树学报，2005，22（5）：483-487.

[12] 周厚成，李思源，何水涛，等.草莓镶脉病毒的PCR检测及特异片段的序列分析[J].果树学报，2005，22（3）：286-288.

[13] HULL R，SHEPHERD R J.Cauliflower mosaic virus： An improved purification procedure and some properties of the virus particles[J].Journal of general virology，1976，31：93-100.

[14] 章绍延，王健华，谭老喜，等.一辣椒环斑病毒提纯及抗血清制备[J].热带作物学报，2013，34（3）：534-537.

[15] 洪 健，李德葆，周雪平.植物病毒分类图谱[M].北京：科学出版社，2001.

[16] 江 彤，杨友志，丁 菲，等.草莓镶脉病毒外壳蛋白的原核表达及多抗血清制备[J].南京农业大学学报，2012，35（6）：30-34.

[17] 江 彤，谢朝阳，丁 菲，等.草莓镶脉病毒ORF Ⅵ基因的原核表达与抗血清制备[J].植物保护学报，2013，40（6）：511-516.

1.2.3 电镜观察 将病毒提纯液（5 uL）置于2%磷钨酸溶液（pH 6.8）中负染约30 min，用JEM-1230型透射电镜进行观察拍照。

2 结果与分析

2.1 草莓总核酸情况

采用改进的CTAB法抽提的草莓叶片总核酸沉淀呈乳白色，易溶于水，不黏稠，多糖含量较少。经紫外分光光度计测定，核酸浓度为120～400 ng/uL，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0之间。经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，其DNA条带清晰，完整性较好（图1）。

2.2 PCR产物电泳分析

以提取的草莓总核酸为模板，用引物（B1F、B1R）进行PCR反应，扩增获得了与预期片段（574 bp）大小一致的扩增产物。2012年从浙江杭州地区采集可疑症状样品和部分无症状样品共48份，共检出带SVBV阳性材料24份。其中，多代苗中草莓病毒侵染率约为42.8%，而一代苗和二代苗中病毒侵染率低于10.0%；田间曾感染过真菌或细菌病害的草莓病毒侵染率较高，最高的为82.5%，未明显发病区域的病毒侵染率在10%～28%之间。

2.3 基因片段序列测定

选取来源于不同植株的4个阳性克隆进行测序，测序结果表明，4个克隆片段的序列完全一致，序列总长574 bp，在NCBI网站（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov）上进行Blast分析，发现该序列与GenBank中的已知SVBV序列同源。与中国郑州分离物（序列号AY862389）核苷酸同源性最高，为95%；与沈阳分离物（序列号AY955374）同源性为94%，而与美国分离物（序列号NC_001725）同源性为91%。而该区段对应的蛋白质序列与上述3个分离物同源性分别为99%、98%和98%。将测序结果提交GenBank获得序列号KJ774105，同时将此次采集的SVBV分离物定为杭州分离物。

2.4 病毒纯化情况

病毒具有特有的紫外吸收峰，通过紫外分光光度计可以测定推算病毒浓度[14]。采用微量分光光度计测量SVBV病毒提纯液的紫外吸收光谱，发现其OD260 nm为1.454，OD260 nm/OD280 nm为1.41。资料显示[13]，花椰菜花叶病毒消光系数E（0.1%、1 cm、260 nm）为7，根据公式，病毒浓度（mg/mL）=OD260 nm×稀释倍数/E，推算出提纯的病毒浓度约为0.2 mg/mL。

2.5 病毒粒子的形态

病毒提纯液用2%磷钨酸溶液负染后，在透射电镜下可观察到球形的病毒粒子，直径约为40～55 nm，粒子中心可见清晰核心（图2）。该病毒粒子形态与已报道的花椰菜花叶病毒的病毒粒子非常吻合。而对照健康杨叶未观察到类似颗粒。

3 小结与讨论

SVBV是我国草莓的主要病毒病害之一，在吉林、河南、河北、辽宁、山东等地区均有发生，但经检索，未发现在浙江草莓种植区发生该病的报道。本研究发现，杭州地区栽培草莓中也存在SVBV感染。其中，多代苗的侵染率高于低代苗，而炭疽病等真菌感染、蚜虫数量多也会增加SVBV感染率。因此，田间草莓镶脉病毒的防治首先要选取无病毒低代苗作为种苗，同时要注意蚜虫和其他病害的防治。

前人研究表明[6，11，15]，SVBV存在株系分化现象，不同基因型在不同生态地理条件下核酸序列存在变化，即使比较保守的CP基因也有核苷酸的改变。本研究通过序列分析，发现SVBV杭州分离物与郑州分离物同源性最高，与沈阳分离物次之，与美国分离物同源性最低。由此推测，不同株系间基因序列的变异可能是地域差异造成的。因此，在病毒PCR检测的实践中，特异引物的选择设计尤其重要，同时参考几对引物的扩增结果有助于假阴性的识别。

SVBV属花椰菜花叶病毒。在本研究中，参考改进的花椰菜花叶病毒提纯方法[13]，在受侵染的草莓叶片中提纯得到了SVBV病毒。目前，还未有商业化的SVBV抗体研制成功，限制了该病毒的血清学检测。江彤等[16，17]采用通过原核表达获得目的蛋白再免疫兔子的方式制备了SVBV的抗血清。由于利用提纯病毒制备的抗血清本底低、效价高，通过商业途径销售的抗血清多倾向于利用提纯病毒制备。后期研究可用提纯的病毒粒子研究制备抗血清，为该病毒的血清学检测奠定基础。

参考文献：

[1] 王国平，刘福昌，国际翔.我国草莓主栽区病毒种类的鉴定[J].植物病理学报，1991，21（1）：9-14.

[2] HONETSLEGROVA J，MRAZ I，SPAK J.Detection and isolation of strawberry vein banding virus in the Czech Republic[J].Acta Hortie，1995，385：29-32.

[3] MORRIS T J，MULLIN R H，SCHLEGEL D E.Isolation of a caulimovirus from strawberry tissue infected with strawberry vei banding virus[J]. Phytopathology，1980，70：156-160.

[4] MASS J L.草莓病虫害概论[M].第二版.张运涛，张国珍，译.北京：中国农业出版社，2012.

[5] PETRZIK K，BENES V，MRAZ I，et al.Strawberry vein banding vires-definitive member of the genus Caulimovirus[J].Vires Genes，1998，16（3）：303-305.

[6] MRAZ I，PETRZIK K，SIP M，et al.Variability in coat protein homology among American and European sources of strawberry vein binding virus[J]. Plant Disease，1998，82：544-546.

[7] 肖 敏，张志宏.草莓镶脉病毒研究进展[J].辽宁农业科学，2005（4）：36-38.

[8] ROBERT R M，IOANNIS E T.Characterization and recent advances in detection of strawberry viruses[J]. Plant Disease，2006， 90（4）：384-396.

[9] 陈晓军，王敬东，马洪爱，等.草莓镶脉病毒检测方法研究[J].北方园艺，2010 （22）：123-125.

[10] 隋 春，吴禄平，张志宏.利用PCR技术检测草莓镶脉病毒[J].园艺学报，2003，30（1）：82-84.

[11] 肖 敏，张志宏，代红艳，等.PCR检测草莓镶脉病毒的稳定性研究[J].果树学报，2005，22（5）：483-487.

[12] 周厚成，李思源，何水涛，等.草莓镶脉病毒的PCR检测及特异片段的序列分析[J].果树学报，2005，22（3）：286-288.

[13] HULL R，SHEPHERD R J.Cauliflower mosaic virus： An improved purification procedure and some properties of the virus particles[J].Journal of general virology，1976，31：93-100.

[14] 章绍延，王健华，谭老喜，等.一辣椒环斑病毒提纯及抗血清制备[J].热带作物学报，2013，34（3）：534-537.

[15] 洪 健，李德葆，周雪平.植物病毒分类图谱[M].北京：科学出版社，2001.

[16] 江 彤，杨友志，丁 菲，等.草莓镶脉病毒外壳蛋白的原核表达及多抗血清制备[J].南京农业大学学报，2012，35（6）：30-34.

[17] 江 彤，谢朝阳，丁 菲，等.草莓镶脉病毒ORF Ⅵ基因的原核表达与抗血清制备[J].植物保护学报，2013，40（6）：511-516.