中国杨树多倍体诱导研究现状

费希同　唐军荣　周军　林源　巨苗苗　辛培尧

摘要：杨树具有分布广、适应性强、生长迅速等特点，是造林绿化的重要树种。杨树多倍体诱导已成为近年来杨树育种的热点，培育出的良种具有生长快、抗性强和品质优的特点。该育种方法为林木育种提供了更为广阔的发展空间。对近年来杨树多倍体的诱导、鉴定等方面进行了概述，并对存在的问题提出了解决的建议，以期为杨树多倍体育种提供理论参考。

关键词：杨树；多倍体；诱导；研究现状

中图分类号：S792.11；S722.3+5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）18-4252-05

多倍体是指生物体细胞中含有两套以上的基因组，是生物进化的重要形式。在被子植物中，多倍体出现的频率在30%～35%，而目前认为在进化过程中70%以上的种类均经历过多倍化，这一过程为自然界提供了丰富的基因资源[1]。自然界中尤其是在植物界，存在着大量的多倍体，其中许多都表现出优良的性状。杨树是世界上最普遍的树种之一，具有分布广、适应性强、生长迅速等特点，将多倍体诱导技术与杨树育种相结合，有望培育出优良的杨树品种。

杨树多倍体植株在生长速度、品质以及代谢物方面具有很强的优势[2]。其表型通常在一些性状上优于二倍体[3]。具体表现在巨大性、抗性和一些生理结构的变化，例如生长量增加、抗寒、抗旱、抗病虫害、器官大小、成分含量等[4]。培育出的三倍体欧洲山杨抗干旱和瘠薄性能较其亲本二倍体有明显的优势，并且还有较强的抗病虫害的能力[5]。杨树的多倍体具有较高的经济、生态和社会价值，并具有巨大的开发潜力[6-8]。例如欧洲山杨（Populus tremula）×美洲山杨（Populus tremuloides）杂交培育的三倍体植株的材积是山杨的100%～200%，纤维长度增加近20%[9]。毛白杨（Populus tomentosa）在自然条件下发现其三倍体植株，倍性优势显著，遗传改良效果明显高于二倍体，与毛白杨的二倍体相比木材产量可增加100%以上，纤维长度提高近30%，出浆率是同种二倍体的200%，并且是高档新闻纸和胶印纸的上等材料，是目前解决造纸原料的最佳品种[7，9-11]。实践证明，杨树的三倍体植株不仅在材积上优于二倍体，而且在木材理学方面也有良好的表现，并且遗传性状较好，具有重要的研究价值和开发价值[7，12]。

杨树多倍体育种研究主要集中在两方面，一方面是选育速生、高产、抗性强等优良品种；另一方面是提高多倍体诱导的效率。木本植物物种的丰富性以及无性繁殖等特点，极大地发挥了多倍体育种的优势[13]。对杨树多倍体育种过程中诱导途径、鉴定方法以及育种现状进行概述，并就目前存在的问题提出建议，以期对杨树多倍体育种研究提供一定的理论参考。

1 杨树多倍体诱导方法

1.1 化学诱导法

化学诱导法是利用化学诱变剂对植物染色体进行加倍的一类手段。此类方法的原理为，施加化学物质作用于植物微管蛋白上，致使细胞分裂形成纺锤丝的过程受到抑制，导致染色体不能移向两级，使细胞停留在细胞分裂中期，从而形成染色体加倍[12]。化学诱导法对分裂活跃的器官、组织或细胞的诱导效果明显，所以在选择该方法的同时，应注意试验材料的选取，原则上应选取茎尖、根尖、萌动的种子、愈伤组织等分裂细胞较多的材料。目前使用的化学诱导剂有戊炔草胺、氟乐灵、安磺灵、秋水仙素等[14]，而秋水仙素被认为是最为有效的诱导剂[15-20]。

1.1.1 注射法 使用注射器直接将秋水仙素等药剂注射到待处理部位，此方法适用于杨树2n花粉和2n大孢子的诱导[13]。有学者利用注射法探索四种抗微管物质对白杨的诱导效果，结果发现用200μmol/L戊炔草胺注射花芽效果最好，2n花粉诱导率为84.4%，且最为经济。该方法快速高效，药剂投放准确，但在实施过程中，由于注射药剂量有限，有时不能达到所需剂量，而且在注射过程中会造成组织的损伤，往往会影响诱导效果。

1.1.2 浸泡法 即用一定浓度的秋水仙素或其他诱导剂，将待诱导材料直接浸泡在药液中。此方法适用于杨树合子和胚囊体的染色体加倍[13]。具有操作简便，推广性强，适用材料广的优点。研究表明，以哲引3号杨为母本，以小青杨和北京杨为父本，授粉后用秋水仙素浸泡雌花序，得到青杨杂种三倍体[20]。Einspahr[21]将美洲山杨受精后的花序浸泡在0.3%的秋水仙素溶液中6 h，成功获得四倍体植株，并创造性地解决了诱导杨树多倍体中产生嵌合体的问题。这些研究均证明了授粉后采用秋水仙素处理是一种高效可行的三倍体诱导方案。

1.1.3 涂抹法 将配制好的诱导药剂涂抹于材料表面。适用于杨树幼苗茎尖染色体加倍[12]。国内研究者采用秋水仙素处理美洲黑杨（P. deltoides）与小叶杨（P. simonii）杂交产生子一代并作为多倍体诱导的材料，先用镊子将苗木顶端的小叶去掉，再用脱脂棉将生长点包裹住，最后将秋水仙素滴加在脱脂棉上。结果证明，诱导产生的四倍体植株在叶绿素含量和株高等方面均优于父母本[22]。该方法操作简便，药剂用量少，不需损伤植物体且可以对生长中的杨树进行诱导，便于恢复，试验周期短。

1.1.4 混培法[16] 该法是将待处理材料接种在附加有诱导剂的组织培养基上培养。利用这种方法较适用于杨树的幼叶、愈伤组织、嫩茎以及叶柄等材料[12，20，23-25]。西南林业大学以滇杨叶柄为外植体，先在分化培养基中预培养5 d，继而在附加有40 mg/L秋水仙素的分化培养基中诱导处理2 d，其诱导变异率可达51%[24]。此外，刘岩[23]将滇杨叶柄在附加有80～90 mg/L秋水仙素的分化培养基上培养30 d时，多倍化性状明显，诱导率可达16.18%。此方法诱导效果较好，可有效地减少嵌合体，试验条件易于控制且重复性强，在多倍体育种中有广泛的应用。

1.2 物理诱导

物理诱导一般采用温度、机械损伤、γ射线等物理因素来诱使染色体加倍。石乐等[26]以毛新杨（Populus tomentosa × P. bolleana）×新疆杨（Populus alba var. pyramidalis Bunge）杂交，同时进行39℃高温处理，四倍体诱导率最高可达7.4%，并获得一定数量的三倍体。北京林业大学采用40～44 ℃的高温和-2 ℃低温的极端温度的方法诱导毛新杨、银毛杨（P. alba × P. tomentosa）、银腺杨（P. alba × P. glandulosa）雌花芽，结果证明均可产生三倍体植株，并确定了处理雌花芽的最佳时期为水培的1～5d。后经试验证明所获三倍体植株具有较好的生长势。他们还利用40 ℃高温处理雄花芽得到66.25%的2n花粉[26，27]。

1.3 自然环境下筛选

利用自然变异，优中选优是植物种质改良的常用方法。在自然条件下，性母细胞在减数分裂过程中由于受到外界条件的影响，染色体没有被分到两个细胞中去，致使在后期花粉受精后，得到了三倍体的后代。1992-1995年，康向阳[28]对保留的无性系中长势较好的60株毛白杨优良无性系进行镜检，发现5株为三倍体，染色体数2n=3x=57，是国内首次在自然界中发现杨树三倍体，为中国杨树多倍体育种做出重要贡献。通过大量筛选，虽然可从自然界直接获取多倍体植株，但是这种变异发生概率极低，导致筛选的工作量较大，往往在实践中不采用这种方式获得多倍体。

1.4 不同倍性的杨树杂交

不同倍性的杨树杂交培育多倍体是获得杨树多倍体的常规思路，当杨树中存在不同倍性的可育植株时，直接通过杂交可以简单快捷地获得多倍体。例如利用四倍体与二倍体杂交就有机会产生三倍体，操作简单，易于掌握，杂交后产生的后代的纯合体，便于后续研究，但在杂交过程中由于双方亲本的倍性关系导致杂交可育性很低，获得多倍体的数量少，因此不利于规模化育种。

1992年，康向阳等[16]用高温处理杨树花粉，得到2n花粉粒，然后与正常雌株杂交培育出三倍体。此后，李云等[27]采用极端温度处理毛新杨、银毛杨和银腺杨诱导培育三倍体均取得成功。此种方式增加了2n配子的数量，从而提高了杂交后代三倍体的数量。康向阳[28]采用人工加倍获得银腺杨与毛新杨的2n花粉，并对其进行正交和反交，银腺杨×毛新杨组合三倍体获得率为3.8%；而毛新杨×银腺杨组合则获得12.9%的三倍体。经栽培试验证明，获得的两种三倍体均有明显的正向超亲优势。李云等[29]还采用秋水仙素诱导毛新杨、银腺杨、银毛杨使其雌配子染色体加倍，然后采用正常的花粉授粉，获得了种子并培育成苗，经形态判断和镜检成功选育13株三倍体植株，并在苗期具有明显的速生性。此外研究发现响叶杨2n花粉的细胞学机制以后，采用高温法使胚囊染色体加倍，然后授粉并以38 ℃的高温处理，最后获得三倍体诱导率高达83.33%[30]，并同时育出响叶杨四倍体，从而探索出了高效诱导杨树三倍体的方法。

2 多倍体的鉴定

随着多倍体育种技术的广泛使用，多倍体鉴定技术也随之发展。目前鉴定杨树多倍体的方法有间接鉴定法和直接鉴定法。

2.1 间接鉴定法

间接鉴定法是通过杨树形态观察与二倍体进行比较，通常杨树多倍体具有叶片大而厚、叶柄粗而长、叶绿体多、气孔和保卫细胞大、纤维细胞增长等特征，可以初步判断所获得植株是多倍体[13]。杨树多倍体的发现就是在天然的条件下，其表现出巨大性而引起了研究者的注意，所以间接地通过性状对杨树多倍体鉴定是有一定依据的，可以方便快捷地在众多材料中进行初筛。张友鹏等[31]利用气孔间接鉴定法鉴定诱导的多倍体杨树。而国内其他学者在鉴定白杨杂种三倍体时提出根据苗期叶片形状、叶缘锯齿形、叶尖和叶基、主脉与叶基侧脉夹角等形态指标初步鉴定三倍体的技术方法[32]。

近年来出现的流式细胞术（Flow cytometry， FCM）是一种对单细胞或其他生物粒子从功能水平升高进行细胞倍性检测和分析的手段。该手段可以快速地分析上万个细胞，因其方便、快捷、获取数据准确，已经逐渐成为该领域的重要技术之一[12]。北京林业大学已成功地将流式细胞术应用于黑杨派和青杨派多倍体的鉴定中[33，34]。娄玲玲等[35]用大青杨为亲本，雌花序授粉后施加0.2%～0.6%的秋水仙素，成功培育出大青杨同源三倍体，表现出有别于亲本的优良性状，并通过染色体镜检和流式细胞术法进行了鉴定。流式细胞仪有其他方法无法比拟的优越性，例如检测速度快，可获得多重数据，不使用同位素，无放射性污染等。但也有其不足之处，例如价格高昂，检测费用高，仪器操作复杂，材料需要在短时间内进行检测，否则会因为不稳定而导致数据失真等。此外，王君等[36]提出利用细胞间期染色中心数目的最大染色体数目对三倍体进行鉴定的标准，并用该法对青杨派杨树倍性进行了鉴定。他们指出，中心数目大于40且小于60的植株鉴定为三倍体，大于60的鉴定为四倍体。此方法大大提高了倍性鉴定的效率，且多试验材料要求不高。但是直接通过性状判断杨树多倍体存在着可靠性低、不准确的特点，仅通过表现性状鉴定具有很大的偶然性。表现型是通过基因和环境共同决定的，例如后天环境适于生长可能会表现出叶片大、叶柄粗、叶片颜色深等近似多倍体的特点，实际上多倍体杨树也存在性状上不及二倍体的现象，这就为间接鉴定带来了难度。在实际的鉴定中，一般采用两种或两种以上的方法，这样可以保证鉴定的准确性。有学者对于气孔密度单一指标的可靠性较低问题提出了解决方案，指出综合利用气孔密度和气孔面积两个参数可以较准确地鉴定青杨派三倍体[33]。

2.2 直接鉴定法

杨树多倍体的直接鉴定，即直接观察染色体的数目，该鉴定途径最为可靠。

染色体计数法对材料有较高要求，一般选取杨树幼嫩茎尖或幼叶为材料，经解离、漂洗、染色、制片进行观察。康向阳等[28]在0.2%秋水仙素和0.002 mol/L 8-羧基喹啉溶液中预处理3～5 h，然后转入0.075 mol/L KCl溶液低渗处理0.5 h，洗涤，加入纤维素酶和果胶酶酶解3 h，洗涤，加入卡诺固定液，用镊子将材料捣碎，再加入卡诺固定液制成细胞悬液，然后制片，观察到明显的棒状结构的染色体。陈杰[24]利用秋水仙素结合组织培养技术获得四倍体滇杨，并通过形态特征、染色体数量以及气孔大小对多倍体进行了验证，结果证明秋水仙素结合组织培养的方式对于杨树多倍体诱导具有很好的效果，他们发现，诱变后的植株与二倍体相比，染色体数目增加到了76条。

此类多倍体鉴定方法的特点是能比较直观地判断倍性关系，试验器材简单，试验易于进行，是目前仍较为广泛使用的多倍体方法。但二倍体杨树染色体数较多（2n=2X=38），对其加倍后染色体形态及数目就更不易鉴定。因此，建立高效稳定的染色体制片技术是利用该方法实现准确鉴定的前提。

3 问题及建议

杨树多倍体育种是目前较为有效的杨树遗传改良手段，现已在杨树新种质创育方面取得了一定的成就。但在育种过程中仍存在着一些理论及方法上的问题。

3.1 秋水仙素诱导的结果

秋水仙素是目前诱导效果最好的诱变剂。但也存在着一些不足之处，秋水仙素适用于获取同源偶数倍性体，理论上是由二倍体诱导为四倍体。但康向阳等[16]以银腺杨为母本，毛白杨为父本进行授粉，并用秋水仙素处理，意外获得了白杨三倍体植株，其作用机理仍不清楚。采用秋水仙素等诱导剂进行诱导时，得到三倍体还是四倍体仍无法预测。因此，需进一步对秋水仙素诱变的相关机理进行更深层的研究，以提高诱变效果的可预见性。

3.2 2n花粉的诱导

采用2n花粉粒杂交选育三倍体过程中，2n花粉粒诱导率低，在处理花粉粒时，处理时机难以掌握[37]，给诱导处理带来了很大的障碍。而且得到2n花粉粒在杂交过程中要克服单性花粉的竞争，往往导致成功率较低。所以，今后需要加大力度，重点解决如何高效诱导竞争力强的2n花粉，以提高多倍体的得率。

3.3 嵌合体的分离

不论是通过秋水仙素处理种子、顶芽，还是秋水仙素结合组织培养进行多倍体材料的诱导，均存在产生一定量嵌合体的现象。嵌合体在后期大多会恢复为正常二倍体。因此，需要建立快速有效的初筛方法（例如分子标记、流式细胞术等），并利用杨树易于无性繁殖的特性，在早期对嵌合体中的诱变部分进行分离，并通过嫁接、扦插及组织培养等手段将其多倍化性状加以固定。

3.4 后续工作的坚持

育种工作取得的成功，不仅仅是在前人已有工作基础上进行的继续研究，而是对自己前期工作的持之以恒。尤其对生命周期较长的林木来说，这项工作需时更长。通过染色体加倍获得的杨树多倍体材料，要经过多年无性系测定，依育种目标多代选择，其优良性状的稳定性才能最终被确认。因此，需要杨树育种工作者兢兢业业，坚持不懈地完成这项工作，切忌急于求成，半途而废。只有这样，才能最终取得成功，选育出新的优良杨树品种。

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