“逆流-超声-热压”技术在刺五加叶中提取黄酮类化合物的应用

王海蓉 赵 静 赵传玉

（1.哈尔滨申宜科技有限公司，黑龙江 哈尔滨 150090；2.黑龙江省计算中心，150028）

刺五加为五加科植物，又名五加参，其根、茎、叶均可作为药用，是东北地区典型的药用植物，味辛、微苦，无毒。具有益气健脾、益精壮骨、补肾安神之功效。其中的黄酮类化合物更是具有广泛的药理活性，它存在于刺五加的各部位，属叶中含量最高。

随着时代的进步和科学技术的发展，提取刺五加中黄酮类化合物的提取方法也日益广泛应用于黄酮类化合物的提取中，如微波法、超声法、超临界流体萃取法等。传统提取法都有共同的缺点就是提取时间长，溶剂用量大，提取率不高等。现代提取法超临界流体萃取法虽选择性强、提取物纯度高，但由于其操作压力高、能量消耗大、自身成本较高，因而不能进行工业生产。

我们自行研制的“逆流-超声-热压”联用提取技术是基于连续逆流提取技术和超声强化提取技术的融合与改进。在逆流提取过程中，间歇地对被浸提的植物原料进行机械挤压及局部加热，植物原料在机械压力和局部升温的双重作用下，在极短的时间内完成一次彻底的传质交换过程。该技术为我单位最新研发成功的专有技术，目前已经完成样机测试检验，具有工作能耗低、溶媒用量少、提取率高、可低温高效浸提等多方面优势特点。

1.材料与方法

1.1 材料与仪器

刺五加叶，采自黑龙江省七台河市金沙农场。槲皮素标准品，中国药品生物制品检定所；实验所用试剂均为分析纯试剂，北京化工试剂厂；实验用水由蒸馏水经纯化器纯化所得。

自主研发的“逆流-超声-热压”联用提取设备；BS-124，电子天平，Sartorius AG，德国；紫外可见分光光度计，上海分析仪器公司；旋转蒸发器，上海；TDL-5-A低速大容量离心机，上海安宁科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理

将新鲜的黑龙江省刺五加叶洗净、晒干、粉碎，放在干燥器中备用。

1.2.2 标准品的制备

精确称取槲皮素标准品2.00mg，加60%的乙醇定容至50 mL容量瓶中，得到0.2 mg/mL 的标准品溶液。5 % NaNO2吸光度（A）为纵坐标，对照品浓度（C）为横坐标绘制标准曲线。

1.2.5 正交试验设计

为进一步优化“逆流-超声-热压”联用提取技术提取刺五加叶中黄酮类化合物的实验条件，以溶剂浓度，提取时间、提取次数和料液比作为提取因素，按照L9（3）4进行提取，如表1所示。溶液：称取5g分析纯NaNO2，用蒸馏水溶解后定容至100 mL；10 % Al（NO3）3溶液：称取10g 分析纯Al（NO3）3用蒸馏水定容至100 mL；4 % NaOH溶液：称取4 g分析纯NaOH，用蒸馏水溶解后定容至100 mL。

表1 正交实验因素水平表

1.2.3 “逆流-超声-热压”联用提取法

由于该实验使用的是企业中试型设备，所以，刺五加叶原料的使用量和溶剂的使用量较多。首先取出2.5kg用50%的工业乙醇在提取设备内提取，提取时间为 1.5 h，料液比为20倍，将提取液合并后用石油醚处理，直至浸提液无色，使叶绿素和其它亲脂性物质完全除去。最后将提取液减压蒸馏至干。取刺五加粉末3份，每份约2.5000±0.0002 g，用60%的乙醇分别溶解并定容在250 mL容量瓶中，冷藏备用。

1.2.4 总黄酮含量的测定

采用硝酸铝-亚硝酸钠法,取0.2 mL提取液于5mL的容量瓶中，加入0.2 mL 5% NaNO2溶液，摇匀，静置6 min；分别加入0.2 mL 10% Al（NO3）3溶液，摇匀，静置 6 min；再分别加入1.0 mL 4%NaOH 溶液，用 60%乙醇定容，摇匀，静置 15 min，在500nm处测吸光度。以

2 结果与讨论

2.1 溶剂浓度对“逆流-超声-热压”联用提取技术提取率的影响

料液比为1：20，提取时间为2h，用不同浓度的乙醇溶液为提取溶剂进行提取2次，乙醇溶液浓度分别为30%、40%、50%、70%、80%、100%。采用分光光度法测定各提取液中总黄酮的含量。

从实验结果发现，总黄酮的含量随着乙醇浓度的增加而增加，当乙醇含量为50%时，提取的总黄酮含量为53.23mg/g，总黄酮含量最高；而后虽乙醇浓度的增加，总黄酮含量减少，可见采用50%的乙醇溶液提取刺五加叶中黄酮类化合物的效果最佳。

2.2 提取时间对提取率的影响

用50%乙醇，料液比为1：20，在不同的提取时间：1h、1.5h、2h、2.5h、3h，进行提取2次,采用分光光度法测定各提取液中总黄酮的含量。

从实验结果得出：随着时间的增加，总黄酮含量相应增加，但是提取时间2h后，增加幅度明显减小，所以选择提取时间为2h。

2.3 提取次数对提取率的影响

提取溶剂乙醇含量为50%，料液比为1：20，用不同的提取次数：1次、2次、3次、4次，提取2h，采用分光光度法测定各提取液中总黄酮的含量。

表2 正交实验结果表

表3 正交实验方差分析表

表4 最佳工艺条件的验证结果

从实验结果得出，随着提取次数的增加，总黄酮含量增加，增加幅度逐渐减慢。考虑到经济实用等方面因素，选择提取2次最为合适。

2.4 料液比对提取率的影响

提取溶剂乙醇含量为50%，提取时间 2h，在不同的料液比：1：10、1：15、1：20、1：25、1：30，提取 2 次，采用分光光度法测定各提取液中总黄酮的含量。

从实验结果得出，随着溶剂用量的增加，总黄酮含量也增加。当溶剂用量达到20倍后，刺五加液中总黄酮含量基本保持不变，所以从节约成本等多方面因素选择溶剂用量为20倍。

2.5 正交实验的考察

2.5.1 结果及方差分析

以溶剂浓度、提取时间、提取次数和料液比作为四因素进行L9（3）4正交试验，得到实验结果如表2所示：

正交实验的方差分析结构如表3：

结合极差分析和方差分析可知，溶剂浓度、提取时间、料液比三因素对总黄酮提取量的影响主次顺序为：提取次数（C）>溶剂浓度（A）>料液比（D）＞提取时间（B）,最佳的提取条件为：A2B1C2D3，即溶剂浓度为50%，提取时间为2h，提取次数为2次，料液比为1：20。

2.5.2 最佳工艺的验证

在优化组合A2B1C2D3的条件下，进行三次平行验证试验，以验证最优工艺的可行性和合理性。结果如表4所示，在最优提取工艺下，提取的总黄酮的平均含量为53.85mg/g，相对标准偏差为0.85%，该方法可行性较高。

结语

通过采用“逆流-超声-热压”联用提取技术提取刺五加叶中的黄酮类化合物，间歇地对原料进行热压和释放作用，提取效率显著提高。因而确定最佳实验条件为：溶剂为50%乙醇、提取时间为2h、提取次数2次、料液比为1：20。此新设备具有耗能低、提取效率高、操作简单、成本低廉等特点，为更好的开发利用刺五加叶中的黄酮类化合物提供了实验参考和依据。

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