基于磷脂脂肪酸提取方法的微生物群落结构研究

摘要：选取川西高原土壤和凋落物作为研究对象，分别取1、3、5、8、10 g土壤和0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g凋落物用于PLFA（磷脂脂肪酸）的提取。经试验确定，土壤和凋落物用于PLFA提取的最佳提取量分别为8 g和1.0 g，用超声波提取替代振荡提取，缩短了PLFA方法的提取时间。进一步分析土壤和凋落物中微生物群落结构信息，结果表明，相同环境下土壤和凋落物中大部分微生物类群的种类和含量都十分接近，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌更有优势，厌氧菌比好养菌更加活跃。

关键词：土壤；凋落物；PLFA（磷脂脂肪酸）；微生物群落结构

中图分类号： S154.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0323-03

收稿日期：2013-10-30

基金项目：国家自然科学基金 （编号：31170916 ）；中国科学院仪器设备功能开发技术创新项目（编号：yg20110708）。

作者简介：李范（1988—），男，四川自贡人，硕士研究生，主要研究方向为土壤微生物。E-mail：554063409@qq.com。

通信作者：李萍，博士，教授，硕士生导师。E-mail：wuping4535@sina.com。 土壤和凋落物中存在极其丰富的微生物，它们直接影响着土壤的结构、肥力以及养分转化等，通过磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）方法可以对微生物群落进行定量分析。本研究首次采用超声波方法提取森林土壤及凋落物中PLFA，探讨各提取条件得到的PLFA含量差异，并分析森林土壤和凋落物间微生物群落结构及其相互作用。

1材料与方法

1.1试验材料

试验土壤与凋落物均取自中国科学院茂县山地生态系统定位研究站，地理坐标（31°41′N，103°53′ E），属暖温带亚高山季风气候，冬季寒冷干燥、夏季多雨，土壤pH值为5.8～60，年平均温度为8.9 ℃，年降水量919.5 mm。取表层0～20 cm 土壤并混匀，过2 mm筛，去掉石块植物残根等杂物，装入塑封袋后置于放有冰袋的泡沫箱运回实验室，于-70 ℃保存，7 d内完成PLFA测定。

凋落物收集于分解试验开始前半年进行，样方内均匀设置凋落物收集框，框的大小为2 m（长）×2 m（宽）×20 cm（高），底部安装有孔径为8 mm的尼龙网。收集时间为1个季度，将收集到的凋落物样品去除网内杂物，将枝叶以枝与叶的重量比为1 ∶1的比例混合均匀，将收集到的凋落物放入分解袋，再将分解袋放置在采样地表周围，本次试验采用的塑料网袋为20（长） cm×20（宽） cm、网眼为1 mm，并在下一季度取回，低温保存带回实验室，测重后将凋落物碾碎进行磷脂脂肪酸分析。

1.2试验方法

为了确定土壤跟凋落物中PLFA的最适提取量，土壤分别取1、3、5、8、10 g，凋落物分别取0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g用于PLFA的提取，加入足量的提取剂 （25 mL），保证不同样品量的凋落物和土壤都能得到充分的提取，进而确定各自最佳取样量。

为了确定提取方法对提取效率的影响，同时为了验证超声波提取样品中的PLFA能否在传统振荡提取的基础上用更短的时间提出PLFA，本试验采用有机质含量较高的黑土作为研究对象，具体方法为：第1次提取，振荡时间设120 min，超声时间分别设20、30、40、50、60 min，第2次提取方法与第1次提取方法相同，提取时间分别减半。用2次提取的PLFA总含量来衡量提取效率。

从-70 ℃的冰箱中取出经冷冻干燥的土壤及掉落物，用氯仿-甲醇-柠檬酸缓冲液（ 体积比为1：2：0.8）作提取剂振荡提取脂类[1]，再用100 μL 25 mg/L的C19做内标溶解氮吹干的脂肪酸甲酯，通过带有MIDI峰识别软件的Agilent N6850气相色谱进行分析。

2试验结果

2.1土壤中PLFA含量的分析

在3 g土壤中检测得到的单体PLFA数为24个，而在8 g土壤中则增加到了29个，10 g土壤中单体PLFA的数量比 3 g 土壤中多6个，在土壤小于8 g时，检测到的PLFA数量随着土壤量的增加而增加（表1）endprint

摘要：选取川西高原土壤和凋落物作为研究对象，分别取1、3、5、8、10 g土壤和0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g凋落物用于PLFA（磷脂脂肪酸）的提取。经试验确定，土壤和凋落物用于PLFA提取的最佳提取量分别为8 g和1.0 g，用超声波提取替代振荡提取，缩短了PLFA方法的提取时间。进一步分析土壤和凋落物中微生物群落结构信息，结果表明，相同环境下土壤和凋落物中大部分微生物类群的种类和含量都十分接近，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌更有优势，厌氧菌比好养菌更加活跃。

关键词：土壤；凋落物；PLFA（磷脂脂肪酸）；微生物群落结构

中图分类号： S154.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0323-03

收稿日期：2013-10-30

基金项目：国家自然科学基金 （编号：31170916 ）；中国科学院仪器设备功能开发技术创新项目（编号：yg20110708）。

作者简介：李范（1988—），男，四川自贡人，硕士研究生，主要研究方向为土壤微生物。E-mail：554063409@qq.com。

通信作者：李萍，博士，教授，硕士生导师。E-mail：wuping4535@sina.com。 土壤和凋落物中存在极其丰富的微生物，它们直接影响着土壤的结构、肥力以及养分转化等，通过磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）方法可以对微生物群落进行定量分析。本研究首次采用超声波方法提取森林土壤及凋落物中PLFA，探讨各提取条件得到的PLFA含量差异，并分析森林土壤和凋落物间微生物群落结构及其相互作用。

1材料与方法

1.1试验材料

试验土壤与凋落物均取自中国科学院茂县山地生态系统定位研究站，地理坐标（31°41′N，103°53′ E），属暖温带亚高山季风气候，冬季寒冷干燥、夏季多雨，土壤pH值为5.8～60，年平均温度为8.9 ℃，年降水量919.5 mm。取表层0～20 cm 土壤并混匀，过2 mm筛，去掉石块植物残根等杂物，装入塑封袋后置于放有冰袋的泡沫箱运回实验室，于-70 ℃保存，7 d内完成PLFA测定。

凋落物收集于分解试验开始前半年进行，样方内均匀设置凋落物收集框，框的大小为2 m（长）×2 m（宽）×20 cm（高），底部安装有孔径为8 mm的尼龙网。收集时间为1个季度，将收集到的凋落物样品去除网内杂物，将枝叶以枝与叶的重量比为1 ∶1的比例混合均匀，将收集到的凋落物放入分解袋，再将分解袋放置在采样地表周围，本次试验采用的塑料网袋为20（长） cm×20（宽） cm、网眼为1 mm，并在下一季度取回，低温保存带回实验室，测重后将凋落物碾碎进行磷脂脂肪酸分析。

1.2试验方法

为了确定土壤跟凋落物中PLFA的最适提取量，土壤分别取1、3、5、8、10 g，凋落物分别取0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g用于PLFA的提取，加入足量的提取剂 （25 mL），保证不同样品量的凋落物和土壤都能得到充分的提取，进而确定各自最佳取样量。

为了确定提取方法对提取效率的影响，同时为了验证超声波提取样品中的PLFA能否在传统振荡提取的基础上用更短的时间提出PLFA，本试验采用有机质含量较高的黑土作为研究对象，具体方法为：第1次提取，振荡时间设120 min，超声时间分别设20、30、40、50、60 min，第2次提取方法与第1次提取方法相同，提取时间分别减半。用2次提取的PLFA总含量来衡量提取效率。

从-70 ℃的冰箱中取出经冷冻干燥的土壤及掉落物，用氯仿-甲醇-柠檬酸缓冲液（ 体积比为1：2：0.8）作提取剂振荡提取脂类[1]，再用100 μL 25 mg/L的C19做内标溶解氮吹干的脂肪酸甲酯，通过带有MIDI峰识别软件的Agilent N6850气相色谱进行分析。

2试验结果

2.1土壤中PLFA含量的分析

在3 g土壤中检测得到的单体PLFA数为24个，而在8 g土壤中则增加到了29个，10 g土壤中单体PLFA的数量比 3 g 土壤中多6个，在土壤小于8 g时，检测到的PLFA数量随着土壤量的增加而增加（表1）endprint

摘要：选取川西高原土壤和凋落物作为研究对象，分别取1、3、5、8、10 g土壤和0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g凋落物用于PLFA（磷脂脂肪酸）的提取。经试验确定，土壤和凋落物用于PLFA提取的最佳提取量分别为8 g和1.0 g，用超声波提取替代振荡提取，缩短了PLFA方法的提取时间。进一步分析土壤和凋落物中微生物群落结构信息，结果表明，相同环境下土壤和凋落物中大部分微生物类群的种类和含量都十分接近，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌更有优势，厌氧菌比好养菌更加活跃。

关键词：土壤；凋落物；PLFA（磷脂脂肪酸）；微生物群落结构

中图分类号： S154.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0323-03

收稿日期：2013-10-30

基金项目：国家自然科学基金 （编号：31170916 ）；中国科学院仪器设备功能开发技术创新项目（编号：yg20110708）。

作者简介：李范（1988—），男，四川自贡人，硕士研究生，主要研究方向为土壤微生物。E-mail：554063409@qq.com。

通信作者：李萍，博士，教授，硕士生导师。E-mail：wuping4535@sina.com。 土壤和凋落物中存在极其丰富的微生物，它们直接影响着土壤的结构、肥力以及养分转化等，通过磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）方法可以对微生物群落进行定量分析。本研究首次采用超声波方法提取森林土壤及凋落物中PLFA，探讨各提取条件得到的PLFA含量差异，并分析森林土壤和凋落物间微生物群落结构及其相互作用。

1材料与方法

1.1试验材料

试验土壤与凋落物均取自中国科学院茂县山地生态系统定位研究站，地理坐标（31°41′N，103°53′ E），属暖温带亚高山季风气候，冬季寒冷干燥、夏季多雨，土壤pH值为5.8～60，年平均温度为8.9 ℃，年降水量919.5 mm。取表层0～20 cm 土壤并混匀，过2 mm筛，去掉石块植物残根等杂物，装入塑封袋后置于放有冰袋的泡沫箱运回实验室，于-70 ℃保存，7 d内完成PLFA测定。

凋落物收集于分解试验开始前半年进行，样方内均匀设置凋落物收集框，框的大小为2 m（长）×2 m（宽）×20 cm（高），底部安装有孔径为8 mm的尼龙网。收集时间为1个季度，将收集到的凋落物样品去除网内杂物，将枝叶以枝与叶的重量比为1 ∶1的比例混合均匀，将收集到的凋落物放入分解袋，再将分解袋放置在采样地表周围，本次试验采用的塑料网袋为20（长） cm×20（宽） cm、网眼为1 mm，并在下一季度取回，低温保存带回实验室，测重后将凋落物碾碎进行磷脂脂肪酸分析。

1.2试验方法

为了确定土壤跟凋落物中PLFA的最适提取量，土壤分别取1、3、5、8、10 g，凋落物分别取0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g用于PLFA的提取，加入足量的提取剂 （25 mL），保证不同样品量的凋落物和土壤都能得到充分的提取，进而确定各自最佳取样量。

为了确定提取方法对提取效率的影响，同时为了验证超声波提取样品中的PLFA能否在传统振荡提取的基础上用更短的时间提出PLFA，本试验采用有机质含量较高的黑土作为研究对象，具体方法为：第1次提取，振荡时间设120 min，超声时间分别设20、30、40、50、60 min，第2次提取方法与第1次提取方法相同，提取时间分别减半。用2次提取的PLFA总含量来衡量提取效率。

从-70 ℃的冰箱中取出经冷冻干燥的土壤及掉落物，用氯仿-甲醇-柠檬酸缓冲液（ 体积比为1：2：0.8）作提取剂振荡提取脂类[1]，再用100 μL 25 mg/L的C19做内标溶解氮吹干的脂肪酸甲酯，通过带有MIDI峰识别软件的Agilent N6850气相色谱进行分析。

2试验结果

2.1土壤中PLFA含量的分析

在3 g土壤中检测得到的单体PLFA数为24个，而在8 g土壤中则增加到了29个，10 g土壤中单体PLFA的数量比 3 g 土壤中多6个，在土壤小于8 g时，检测到的PLFA数量随着土壤量的增加而增加（表1）endprint