1株产纤维素酶丝状真菌产油工艺的优化

摘要：以1株峡串脉孢霉为材料，利用玉米秸秆纤维素为主要碳源，以产油率为指标，通过单因素及正交试验方法优化产油发酵工艺，发现最优产脂发酵工艺为：碳源为2%纤维素+2%葡萄糖，氮源为硝酸铵，温度为28 ℃，培养时间为5 d，初始pH值为4，C/N比为8 ∶1。氮源选择具有统计学上的显著性，所做交互作用不明显。

关键词：丝状真菌；产油工艺；正交试验；纤维素酶；峡串脉孢霉

中图分类号： Q939.9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0316-02

收稿日期：2013-10-13

基金项目：忻州师范学院科研项目（编号：201005）。

作者简介：张玲秀（1975—），男，山西定襄人，硕士，助教，主要从事资源微生物和应用微生物研究。E-mail：twozeroxiu@126.com。纤维素类物质是地球上分布最广、含量最丰富的碳源物质，是自然界中数量最大的可再生资源，纤维素的转化利用对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题，具有十分重要的意义。通过菌种选育和发酵工艺等基础研究，分离和筛选出针对不同行业的高效纤维素分解菌群，有望解决纤维素酶产量和活性都不高、成本偏高的问题[1]。最近，石油价格波动和国家能源安全的需求，促使全球发展可持续生物工艺替代传统的石油加工，通过微生物代谢，生产下一代生物燃料，包括游离脂肪酸、长链脂肪醇和酯类、长链烯烃等。工程菌株可利用糖类来生产生物燃料，通过传统的工艺优化进一步提高产量[2]。试验所使用的丝状真菌，不仅可高产纤维素酶（45.32 U），而且菌体可积累14.24%的油脂，具有一定的应用价值和进一步研究的必要性[3]。本试验对该真菌产纤维素酶和胞内产油脂的工艺进行优化，旨在筛选高效降解纤维素和产油脂菌株的基础上，建立一种利用农业秸秆生产微生物油脂的工艺。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验菌株所用菌株为忻州师范学院筛选获得的1株峡串脉孢霉（Paepalopsis Kühn），该菌株的纤维素酶活和滤纸酶活均高于里氏木霉（Trichoderma reesei）[3]。

1.1.2培养基产脂发酵培养基：玉米秸秆纤维素（CMC）2%，酵母膏0.3%，柠檬酸三钠0.1%，硝酸钠0.3%，K2HPO4 0.1%，KCl 0.05%，FeSO4·7H2O 0.015%，CaCl2、CuSO4、ZnSO4 均为0.004%，1×105 Pa灭菌30 min。

1.1.3主要仪器UV2550紫外可见光谱（日本岛津）；SY-305B 发酵罐，由上海世远生物设备工程有限公司生产；YXQ-LS-50G 立式压力蒸汽灭菌器，由上海博迅实验有限公司医疗设备厂生产；天平，由梅特勒托利多仪器有限公司生产；THZ-98A恒温振荡器，由上海一恒科学仪器有限公司生产；旋转蒸发仪，由上海亚荣生化仪器厂生产。

1.2试验方法

1.2.1油脂含量的测定菌种在PDA培养基试管斜面上 27 ℃ 培养活化3次后转接到产脂发酵培养基中，再经5 d振荡培养，收集菌体，用水充分洗涤后80 ℃烘干，称质量。干菌体用氯仿-甲醇（体积比2 ∶1）混合溶剂在索氏抽提器中 80 ℃ 回流6 h，用旋转蒸发仪减压，去除溶剂得粗油脂，再用石油醚充分溶解粗油脂后，过滤去除杂质，减压蒸馏去除石油醚即得油脂，称质量。油脂质量与干菌体质量之比即为产油率[4]。

1.2.2单因素及正交优化设计本试验单因素优化选取6个因素：纤维素浓度、氮源、培养温度、培养时间、初始pH值、C/N，以含油率为指标，得到各因素最适水平。在单因素试验的基础上进一步做L27（313）正交优化试验（表1、表2）。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1碳源对产油率的影响通过改变产脂发酵培养基中纤维素浓度和葡萄糖（Glu）的添加量，进行最适碳源浓度的筛选。由图1可知，随着纤维素浓度升高，产油率不断提高，当增加到一定浓度时则产油率不再提高，2%纤维素+2%葡萄糖（Glu）为最适碳源，产油率为14.48%，这可能是因为碳源达到饱和后，将不再影响产油率。另外，一定量的葡萄糖将有助于提高产油率，这是因为葡萄糖作为可高效利用的碳源，有利于菌体的快速生长。

2.1.2氮源对产油率的影响以2%纤维素+2%的葡萄糖为碳源，分别选取酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵为氮源，对最适氮源进行筛选。由图2可知，硝酸铵为最适氮源，产油率为30%，这可能与菌体积累油脂是在氮缺乏下进行有关，与Gill等的研究结果[5]一致。

2.1.3培养温度对产油率的影响分别采用20、24、28、32、36 ℃等不同培养温度进行培养，结果（图3）表明，28 ℃ 为最佳培养温度，产油率为25.32%，这与丝状真菌菌体最佳生长温度相匹配。

2.1.4培养时间对产油率的影响由图4可见，菌种 1～7 d

不断培养过程中，产油率不断变化；培养5 d产油率最高，达25.41%，为最适培养时间。这是因为菌体在不断生长过程中，随着外界培养条件的恶化，积累油脂量逐渐达到最大值。

2.1.5培养基初始pH值对产油率的影响分别配制初始pH值为2、4、6、8、10的液体培养基，碳源为2%纤维素+2%葡萄糖，氮源为硝酸铵，于28 ℃连续培养5 d后，离心沉淀菌丝体并提取油脂计算产油率。由图5可见，在酸性培养条件下产油率较高，其中初始pH值为4时产油率最高，为24.46%。

2.1.6C/N比对产油率的影响以2%纤维素+2%葡萄糖作为碳源，液体培养基中加入C/N比为2 ∶1、4 ∶1、8 ∶1、12 ∶1、16 ∶1的硝酸铵溶液。由图6可见，C/N比为8 ∶1时产油率最高，可达18.41%。endprint

2.2正交试验结果

正交试验结果见表2。用SPSS Statistics 20软件分析各因素显著性及交互作用，结果见表3。由表3可见，各因素对产油率影响大小依次为氮源>纤维素浓度>初始pH值>C/N比>培养温度。其中，氮源在统计学上显著（P<0.05），纤维素浓度在α=0.1水平上显著，所做3项交互作用不显著。

3小结

本试验以高产纤维素酶的1株丝状产油真菌为材料，利用农业玉米秸秆纤维素为主要碳源，通过单因素及正交试验方法优化产油发酵工艺，发现最优产油发酵工艺为：碳源为2%纤维素+2%葡萄糖，氮源为硝酸铵，温度为28 ℃，培养时间为5 d，初始pH值为4，C/N比为8 ∶1，这为进一步开发和利用农业秸秆、生产微生物油脂提供了参考，具有一定的理论研究意义和实际应用价值。

参考文献：

[1]张传富，顾文杰，彭科峰，等. 微生物纤维素酶的研究现状[J]. 生物信息学，2007，5（1）：34-36.

[2]Perlack R D，Wright L L，Turhollow A F，et al.Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry：the technical feasibility of a billionton annual supply[D]. USDA：Oak Ridge National Laboratory，2005.

[3]张玲秀，温雪梅，郑小妹，等. 降解玉米秸秆纤维素真菌的筛选及产油特性的研究[J]. 安徽农学通报，2012，18（17）：47-49.

[4]刘吉华，袁生，戴传超. 一种新的丝状真菌油脂含量快速鉴定方法[J]. 生物技术，1998，8（1）：43-44，40.

[5]Gill C O，Hall M J，Ratledge C. Lipid accumulation in an oleaginous yeast（Candida 107）growing on glucose in single-stage continuous culture[J]. Applied and Environmental Microbiology，1977，33（2）：231-239.马晓丽，张婷婷，郭欢，等. 红花根际磷细菌筛选、鉴定及其促生效果[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：318-322.endprint

2.2正交试验结果

正交试验结果见表2。用SPSS Statistics 20软件分析各因素显著性及交互作用，结果见表3。由表3可见，各因素对产油率影响大小依次为氮源>纤维素浓度>初始pH值>C/N比>培养温度。其中，氮源在统计学上显著（P<0.05），纤维素浓度在α=0.1水平上显著，所做3项交互作用不显著。

3小结

本试验以高产纤维素酶的1株丝状产油真菌为材料，利用农业玉米秸秆纤维素为主要碳源，通过单因素及正交试验方法优化产油发酵工艺，发现最优产油发酵工艺为：碳源为2%纤维素+2%葡萄糖，氮源为硝酸铵，温度为28 ℃，培养时间为5 d，初始pH值为4，C/N比为8 ∶1，这为进一步开发和利用农业秸秆、生产微生物油脂提供了参考，具有一定的理论研究意义和实际应用价值。

参考文献：

[1]张传富，顾文杰，彭科峰，等. 微生物纤维素酶的研究现状[J]. 生物信息学，2007，5（1）：34-36.

[2]Perlack R D，Wright L L，Turhollow A F，et al.Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry：the technical feasibility of a billionton annual supply[D]. USDA：Oak Ridge National Laboratory，2005.

[3]张玲秀，温雪梅，郑小妹，等. 降解玉米秸秆纤维素真菌的筛选及产油特性的研究[J]. 安徽农学通报，2012，18（17）：47-49.

[4]刘吉华，袁生，戴传超. 一种新的丝状真菌油脂含量快速鉴定方法[J]. 生物技术，1998，8（1）：43-44，40.

[5]Gill C O，Hall M J，Ratledge C. Lipid accumulation in an oleaginous yeast（Candida 107）growing on glucose in single-stage continuous culture[J]. Applied and Environmental Microbiology，1977，33（2）：231-239.马晓丽，张婷婷，郭欢，等. 红花根际磷细菌筛选、鉴定及其促生效果[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：318-322.endprint

2.2正交试验结果

正交试验结果见表2。用SPSS Statistics 20软件分析各因素显著性及交互作用，结果见表3。由表3可见，各因素对产油率影响大小依次为氮源>纤维素浓度>初始pH值>C/N比>培养温度。其中，氮源在统计学上显著（P<0.05），纤维素浓度在α=0.1水平上显著，所做3项交互作用不显著。

3小结

本试验以高产纤维素酶的1株丝状产油真菌为材料，利用农业玉米秸秆纤维素为主要碳源，通过单因素及正交试验方法优化产油发酵工艺，发现最优产油发酵工艺为：碳源为2%纤维素+2%葡萄糖，氮源为硝酸铵，温度为28 ℃，培养时间为5 d，初始pH值为4，C/N比为8 ∶1，这为进一步开发和利用农业秸秆、生产微生物油脂提供了参考，具有一定的理论研究意义和实际应用价值。

参考文献：

[1]张传富，顾文杰，彭科峰，等. 微生物纤维素酶的研究现状[J]. 生物信息学，2007，5（1）：34-36.

[2]Perlack R D，Wright L L，Turhollow A F，et al.Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry：the technical feasibility of a billionton annual supply[D]. USDA：Oak Ridge National Laboratory，2005.

[3]张玲秀，温雪梅，郑小妹，等. 降解玉米秸秆纤维素真菌的筛选及产油特性的研究[J]. 安徽农学通报，2012，18（17）：47-49.

[4]刘吉华，袁生，戴传超. 一种新的丝状真菌油脂含量快速鉴定方法[J]. 生物技术，1998，8（1）：43-44，40.

[5]Gill C O，Hall M J，Ratledge C. Lipid accumulation in an oleaginous yeast（Candida 107）growing on glucose in single-stage continuous culture[J]. Applied and Environmental Microbiology，1977，33（2）：231-239.马晓丽，张婷婷，郭欢，等. 红花根际磷细菌筛选、鉴定及其促生效果[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：318-322.endprint