紫外分光光度法测定向日葵列当中苯乙醇总苷的含量

摘要：比较了超声波提取法、渗滤提取法、热回流提取法等不同提取方法对向日葵列当中苯乙醇总苷的提取效果，结果表明，以热回流方法为佳，80%乙醇回流法提取效果最好，在5.5～27.5 μg/mL范围内线性关系良好，回收率为100.4%，RSD值为2.48%（n=5），向日葵列当中苯乙醇总苷平均含量为1.97%。

关键词：向日葵列当；苯乙醇总苷；紫外分光光度法

中图分类号： O657.32文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0282-03

收稿日期：2013-11-28

基金项目：吉林省吉林市科技计划（编号：201162512）。

作者简介：曲正义（1984—），男，硕士，助理研究员，从事药效质量评价研究。E-mail：qzy209@163.com

通信作者：王英平。E-mail：lyingpingw@126.com。向日葵列当（Orobanche cumana Wallr.）别称毒根草、兔子拐棍，为列当科（Orobanchaceae）列当属（Orobanche）一年生寄生草本植物，在我国分布范围很广，主要分布于黑龙江省、吉林省、北京市、甘肃省、辽宁省、内蒙古自治区、河北省、山西省、陕西省、青海省、新疆维吾尔自治区等地区[1-2]。在我国部分地区，列当属多种植物全草入药，具有强筋壮骨、补肾助阳、抗疲劳、改善脑组织循环、增强免疫力等作用，其主要活性成分为苯乙醇苷类[3-5]。赵梦霞等对列当属植物向日葵列当进行了研究，分离得到4个苯乙醇苷类化合物，分别为crenatoside、isocrenatoside、类叶升麻苷、3-O-methyl-crenatoside。其中crenatoside含量较高，crenatoside具有清除自由基、抗氧化、抗菌、抗衰老等作用[6-7]。目前，国内外对向日葵列当的研究主要以防治、根除为主，对其化学成分及药理活性研究较少，未建立有效的药材质量控制标准[8-10]。为了更好地开发利用向日葵列当资源，缓解素有沙漠“人参”之称的同科植物肉苁蓉资源日益紧缺的局面，笔者采用紫外分光光度法测定向日葵列当中苯乙醇总苷的含量，旨在为进一步开发利用向日葵列当资源提供依据。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

1.1.1材料向日葵列当于2013年9月采于吉林省松原市长岭县，经由中国农业科学院特产研究所姚春林研究员鉴定为向日葵列当的全草。样品经50 ℃烘干粉碎后过40目筛，密封冷藏保存备用。

1.1.2试剂蒸馏水，甲醇、无水乙醇均为分析纯，crenatoside对照品由笔者所在实验室分离纯化并鉴定其结构[6]，纯度>98%。

1.1.3仪器TU-1810型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），HH-6型数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司），N-1001型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司），CPA2250D电子天平（德国Sartorius集团），DHG-9145A 电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒仪器科学有限公司）。

1.2方法

1.2.1对照品溶液的制备crenatoside标准储备液：精密称取5.50 mg标准品，置于10 mL容量瓶中，加甲醇使其溶解，稀释至刻度，摇匀，得crenatoside浓度为0.55 mg/mL的对照品贮备试液备用。

1.2.2供试品溶液的制备

1.2.2.1超声波提取法精密称取向日葵列当干样50.0 g，粉碎并过 40 目筛，置于圆底烧瓶中，以80%乙醇为提取溶剂，溶剂用量为600 mL，超声提取3次，每次50 min，过滤，合并回收浓缩滤液，定容于100 mL容量瓶中。精密吸取1 mL供试品溶液定容至10 mL容量瓶中备用，平行提取3次。

1.2.2.2渗滤提取法精密称取向日葵列当干样50.0 g，粉碎并过 40 目筛，以 80%乙醇为渗漉溶剂（用量为药材干质量的 12 倍），以 1.0 mL/min的流量渗漉24 h，过滤，合并回收浓缩滤液，定容于100 mL供试品溶液容量瓶中。精密吸取1 mL供试品溶液定容至10 mL容量瓶中备用，平行提取3次。

1.2.2.3热回流提取法精密称取向日葵列当干样50.0 g，粉碎并过40目筛，置于圆底烧瓶中，加80%乙醇600 mL，加热回流提取3次，每次1 h，过滤，合并回收浓缩滤液，定容于100 mL容量瓶中。精密吸取1 mL供试品溶液定容至10 mL容量瓶中备用，平行提取3次。根据含量结果，选择提取苯乙醇苷含量高的方法进行供试品溶液制备。

1.2.3最大吸收波长精密吸取对照品、样品溶液各0.4 mL置于20 mL磨口带塞试管中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在230～400 nm处进行紫外扫描，对照品、样品溶液均在333 nm处有最大吸收，因此确定最大吸收波长为333 nm（图1）。

1.2.4标准曲线绘制精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于20 mL磨口带塞试管中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在最大吸收波长下，以甲醇为空白，测定吸光度，以吸光度为横坐标，以crenatoside浓度为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为y=28.709x+0.995 3（r=0.999 0），表明在5.5～27.5 μg/mL范围内crenatoside浓度与吸光度有良好的线性关系（图2）。

1.2.5精密度试验精密吸取对照品溶液0.4 mL置于20 mL 磨口带塞试管中，共6份，按“1.2.4”节方法测定吸光度，连续测定6次。

1.2.6稳定性试验精密吸取样品溶液0.4 mL置于20 mL磨口带塞试管中，按“1.2.4”节方法测定吸光度，每隔2 h 测定1次，共测6次。endprint

1.2.7重复性试验精确称取药材粉末5份，每份50.0 g，按照“1.2.2”方法，平行制备样品溶液，各吸取0.4 mL样品溶液置于5个20 mL具塞试管中，按“1.2.4”节方法测定吸光度。

1.2.8加样回收试验精确吸取5 份已知含量样品溶液04 mL，定容于5个20 mL具塞试管中，分别加入0.55 mg/mL crenatoside对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，按“1.2.4”节方法显色测定吸光度，计算回收率和相对标准偏差RSD值。

1.2.9 样品的测定 精密吸取3份“1.2.2”节中样品溶液各0.4 mL，分别定容于3个20 mL磨口带塞试管中，按“1.2.4”节方法显色测定吸光度，重复测定3次，取其平均值，向日葵列当中苯乙醇总苷含量计算公式如下：

苯乙醇总苷含量=稀释倍数×C×20×10-6×100×100%/m。（1）

式中：C为样品溶液中苯乙醇总苷的含量；m为向日葵列当样品的干质量。

2结果与分析

2.1不同提取方法的苯乙醇总苷含量

由表1可知，热回流提取苯乙醇总苷含量明显高于超声波提取法、渗滤提取法，因此本研究采用热回流提取法。与热回流相比，超声波提取法、渗滤提取法具有提取时间短、无需加热等优点，但向日葵列当中苯乙醇总苷提取率不高，这可能与苯乙醇苷类化合物的种类与结构有关。

3结论

本研究比较了超声波提取法、渗滤提取法、热回流提取法等不同提取方法对向日葵列当中苯乙醇总苷进行提取，结果表明，以热回流方法为佳，80%乙醇回流法提取效果最好，在5.5～27.5 μg/mL范围内线性关系良好，回收率为100.4%，RSD值为2.48%（n=5），向日葵列当中苯乙醇总苷平均含量为1.97%。

参考文献：

[1]汪劲式. 列当王国探奇[J]. 植物杂志，1995（1）：29-31.

[2]刘颖，齐艳春，任丽梅. 向日葵列当发生特点及防除对策[J]. 上海农业科技，2007（1）：102.

[3]江苏新医学院.中药大辞典[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979：8541.

[4]刘晓林，赵秀香，魏颖颖，等. 向日葵列当粗提物对植物病原真菌的抑制作用[J]. 江苏农业科学，2008（3）：104-105.

[5]高昂，姚默，崔超，等. 列当属药学研究概况[J]. 安徽农业科学，2011，39（33）：20394-20395.

[6]赵梦霞. 向日葵列当化学成分及其活性研究[D]. 哈尔滨：哈尔滨工业大学，2012.

[7]曲正义，侯微，金银萍，等. 向日葵列当抗氧化活性研究[J]. 中药材，2010，33（11）：1780-1782.

[8]黄长权. 向日葵列当寄生机理的研究[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2012.

[9]Sauerborn J，Buschmann H，Ghiasi K G，et al. Benzothiadiazole activates resistance in sunflower （Helianthus annuus） to the root-parasitic weed orobanche cuman[J]. Phytopathology，2002，92（1）：59-64.

[10]de Zélicourt A，Letousey P，Thoiron S，et al. Ha-DEF1，a sunflower defensin，induces cell death in Orobanche parasitic plants[J]. Planta，2007，226（3）：591-600.endprint

1.2.7重复性试验精确称取药材粉末5份，每份50.0 g，按照“1.2.2”方法，平行制备样品溶液，各吸取0.4 mL样品溶液置于5个20 mL具塞试管中，按“1.2.4”节方法测定吸光度。

1.2.8加样回收试验精确吸取5 份已知含量样品溶液04 mL，定容于5个20 mL具塞试管中，分别加入0.55 mg/mL crenatoside对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，按“1.2.4”节方法显色测定吸光度，计算回收率和相对标准偏差RSD值。

1.2.9 样品的测定 精密吸取3份“1.2.2”节中样品溶液各0.4 mL，分别定容于3个20 mL磨口带塞试管中，按“1.2.4”节方法显色测定吸光度，重复测定3次，取其平均值，向日葵列当中苯乙醇总苷含量计算公式如下：

苯乙醇总苷含量=稀释倍数×C×20×10-6×100×100%/m。（1）

式中：C为样品溶液中苯乙醇总苷的含量；m为向日葵列当样品的干质量。

2结果与分析

2.1不同提取方法的苯乙醇总苷含量

由表1可知，热回流提取苯乙醇总苷含量明显高于超声波提取法、渗滤提取法，因此本研究采用热回流提取法。与热回流相比，超声波提取法、渗滤提取法具有提取时间短、无需加热等优点，但向日葵列当中苯乙醇总苷提取率不高，这可能与苯乙醇苷类化合物的种类与结构有关。

3结论

本研究比较了超声波提取法、渗滤提取法、热回流提取法等不同提取方法对向日葵列当中苯乙醇总苷进行提取，结果表明，以热回流方法为佳，80%乙醇回流法提取效果最好，在5.5～27.5 μg/mL范围内线性关系良好，回收率为100.4%，RSD值为2.48%（n=5），向日葵列当中苯乙醇总苷平均含量为1.97%。

参考文献：

[1]汪劲式. 列当王国探奇[J]. 植物杂志，1995（1）：29-31.

[2]刘颖，齐艳春，任丽梅. 向日葵列当发生特点及防除对策[J]. 上海农业科技，2007（1）：102.

[3]江苏新医学院.中药大辞典[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979：8541.

[4]刘晓林，赵秀香，魏颖颖，等. 向日葵列当粗提物对植物病原真菌的抑制作用[J]. 江苏农业科学，2008（3）：104-105.

[5]高昂，姚默，崔超，等. 列当属药学研究概况[J]. 安徽农业科学，2011，39（33）：20394-20395.

[6]赵梦霞. 向日葵列当化学成分及其活性研究[D]. 哈尔滨：哈尔滨工业大学，2012.

[7]曲正义，侯微，金银萍，等. 向日葵列当抗氧化活性研究[J]. 中药材，2010，33（11）：1780-1782.

[8]黄长权. 向日葵列当寄生机理的研究[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2012.

[9]Sauerborn J，Buschmann H，Ghiasi K G，et al. Benzothiadiazole activates resistance in sunflower （Helianthus annuus） to the root-parasitic weed orobanche cuman[J]. Phytopathology，2002，92（1）：59-64.

[10]de Zélicourt A，Letousey P，Thoiron S，et al. Ha-DEF1，a sunflower defensin，induces cell death in Orobanche parasitic plants[J]. Planta，2007，226（3）：591-600.endprint

1.2.7重复性试验精确称取药材粉末5份，每份50.0 g，按照“1.2.2”方法，平行制备样品溶液，各吸取0.4 mL样品溶液置于5个20 mL具塞试管中，按“1.2.4”节方法测定吸光度。

1.2.8加样回收试验精确吸取5 份已知含量样品溶液04 mL，定容于5个20 mL具塞试管中，分别加入0.55 mg/mL crenatoside对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，按“1.2.4”节方法显色测定吸光度，计算回收率和相对标准偏差RSD值。

1.2.9 样品的测定 精密吸取3份“1.2.2”节中样品溶液各0.4 mL，分别定容于3个20 mL磨口带塞试管中，按“1.2.4”节方法显色测定吸光度，重复测定3次，取其平均值，向日葵列当中苯乙醇总苷含量计算公式如下：

苯乙醇总苷含量=稀释倍数×C×20×10-6×100×100%/m。（1）

式中：C为样品溶液中苯乙醇总苷的含量；m为向日葵列当样品的干质量。

2结果与分析

2.1不同提取方法的苯乙醇总苷含量

由表1可知，热回流提取苯乙醇总苷含量明显高于超声波提取法、渗滤提取法，因此本研究采用热回流提取法。与热回流相比，超声波提取法、渗滤提取法具有提取时间短、无需加热等优点，但向日葵列当中苯乙醇总苷提取率不高，这可能与苯乙醇苷类化合物的种类与结构有关。

3结论

本研究比较了超声波提取法、渗滤提取法、热回流提取法等不同提取方法对向日葵列当中苯乙醇总苷进行提取，结果表明，以热回流方法为佳，80%乙醇回流法提取效果最好，在5.5～27.5 μg/mL范围内线性关系良好，回收率为100.4%，RSD值为2.48%（n=5），向日葵列当中苯乙醇总苷平均含量为1.97%。

参考文献：

[1]汪劲式. 列当王国探奇[J]. 植物杂志，1995（1）：29-31.

[2]刘颖，齐艳春，任丽梅. 向日葵列当发生特点及防除对策[J]. 上海农业科技，2007（1）：102.

[3]江苏新医学院.中药大辞典[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979：8541.

[4]刘晓林，赵秀香，魏颖颖，等. 向日葵列当粗提物对植物病原真菌的抑制作用[J]. 江苏农业科学，2008（3）：104-105.

[5]高昂，姚默，崔超，等. 列当属药学研究概况[J]. 安徽农业科学，2011，39（33）：20394-20395.

[6]赵梦霞. 向日葵列当化学成分及其活性研究[D]. 哈尔滨：哈尔滨工业大学，2012.

[7]曲正义，侯微，金银萍，等. 向日葵列当抗氧化活性研究[J]. 中药材，2010，33（11）：1780-1782.

[8]黄长权. 向日葵列当寄生机理的研究[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2012.

[9]Sauerborn J，Buschmann H，Ghiasi K G，et al. Benzothiadiazole activates resistance in sunflower （Helianthus annuus） to the root-parasitic weed orobanche cuman[J]. Phytopathology，2002，92（1）：59-64.

[10]de Zélicourt A，Letousey P，Thoiron S，et al. Ha-DEF1，a sunflower defensin，induces cell death in Orobanche parasitic plants[J]. Planta，2007，226（3）：591-600.endprint