山刺玫果提取物的质量标准

摘要：建立山刺玫果提取物的定性鉴别和含量测定方法，采用薄层色谱法对山刺玫果提取物进行定性分析；采用紫外-可见分光光度法建立山刺玫果提取物总黄酮的含量测定方法；采用高效液相色谱法建立山刺玫果提取物中槲皮素的含量测定方法，其中色谱柱为伊利特C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-水-磷酸-三乙胺（50 ∶50 ∶0.45 ∶0.2），流速为1 mL/min，进样量为20 μL，检测波长374 nm，柱温30 ℃。建立的薄层色谱鉴别方法荧光斑点清晰，阴性无干扰；芸香苷在3.70～44.40 μg/mL（r=0.999 7）、槲皮素在0.02～0.20 μg（r=0.999 9）内线性关系良好；芸香苷平均回收率为101.32%，RSD为1.67%（n=9），槲皮素平均回收率99.80%，RSD为1.31%（n=9）。建立的薄层鉴别方法专属性高，含量测定方法具有良好的精密度，结果准确可靠，可用于山刺玫果提取物的质量控制。

关键词：山刺玫果；金丝桃苷；总黄酮；槲皮素

中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0248-03

收稿日期：2013-11-29

基金项目：吉林省科技计划（编号：20110948）。

作者简介：杨扬（1989—），女，吉林吉林人，硕士研究生，主要从事天然产物有效成分的提取及纯化工艺研究。E-mail：15643957455@163.com。

通信作者：钟方丽，博士，教授，主要从事天然产物的研究与开发。E-mail：fanglizhong@sina.com。山刺玫果别称野蔷薇、野玫瑰、蔷薇果，系蔷薇科植物山刺玫（Rosa davurica Pall.）的成熟果实，广泛分布在我国东北及山西、内蒙等地，花、根、果均可入药，其果实为卵形或球形，营养丰富、酸甜可口，可抗衰老，治肠炎、食欲不振，防治心血管疾病等，民间大量采食或用于泡酒、泡茶等，《中药大辞典》认为其有健脾理气、养血调经的作用。据报道，山山刺玫果内含多种维生素、氨基酸及黄酮类化合物等成分，具有很大的开发价值，山刺玫果作为一种具有保健和治疗作用的天然产物被日益重视[1-5]。山刺玫果中所含的总黄酮类物质具有防治高血脂和血栓所致的心脑血管疾病的功效[6-7]，其中芸香苷具有舒张血管、抗病毒、抗衰老等生物活性[8]；槲皮素具有抗炎、抗氧化、清除体内自由基的作用，对由胶原、ADP或凝血酶引起的血小板聚集及血栓形成也有抑制作用，并有免疫增强功能及镇痛等作用[9-10]。本研究以芸香苷为对照品采用紫外-可见分光光度法对山刺玫果提取物总黄酮的含量进行了测定，并采用高效液相色谱法对山刺玫果提取物中的槲皮素量进行了测定。

1材料

1.1试药

山刺玫果提取物（批号20120810、20120820、20121011、20121022、20121103）为吉林化工学院化学与制药工程学院药学系自制。槲皮素对照品（批号：100081-200907），芸香苷对照品（批号：100080-200707），金丝桃苷对照品（批号：111521-201004），均为含量测定用，购于中国食品药品检定研究院。

1.2仪器

TU-1810紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；LC2000高效液相色谱仪（上海天美科学仪器有限公司）；AEG-220电子天平（日本岛津）；KQ-250B超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）；ZF-20D暗箱式紫外分析仪（上海宝山顾村电光仪器厂）。

1.3试剂

薄层色谱硅胶G、H（青岛海洋化工集团公司），甲醇为色谱纯，三乙胺为优级纯，水为重蒸馏水，醋酸乙酯、甲酸、乙醇等其他化学试剂均为分析纯。

2结果与分析

2.1薄层色谱鉴别

2.1.1对照品溶液及供试品溶液的制备精确称取干燥至恒重的金丝桃苷对照品5.05 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容，作为对照品溶液，备用。称取干燥至恒重的山刺玫果提取物0.16 g，精确称定，置于25 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容，吸取5 mL于25 mL容量瓶中，60%乙醇定容，作为供试品溶液，备用。

2.1.2阴性对照液的制备称取干燥至恒重的山刺玫果提取物0.16 g，精确称定，50 mL蒸馏水分散，将上述分散液经过D-101树脂柱，流出液重复上柱，至流出液无黄酮颜色反应，收集流出液，水浴上挥干，用适量60%乙醇溶解，即得除去总黄酮的阴性对照液，备用。

2.1.3结果按《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B 薄层色谱法试验[11-12]，吸取上述金丝桃苷对照品溶液、3批供试品溶液及阴性对照溶液各5 μL，分别点于同一层析硅胶（G）薄层板（市售铝箔片基）上，以醋酸乙酯-甲酸-水（8 ∶1 ∶1）为展开剂展开，取出，晾干，均匀地喷以5%AlCl3-乙醇溶液，用电吹风吹至无有机溶剂气味，置于紫外分析仪（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显有相同颜色的荧光斑点（图1）。

2.2总黄酮含量的测定

2.2.1对照品溶液的制备精确称取干燥至恒重的芸香苷对照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容，摇匀，配制成浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液，备用。

2.2.2供试品溶液的制备按“2.2.1”节的方法制备。

2.2.3标准曲线的绘制精确吸取芸香苷对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加5% NaNO2溶液 1.0 mL，摇匀，放置6 min，加10% Al（NO3）3溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加4% NaOH 10.0 mL，再加60%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min。以相应的试剂为空白，按照分光光度法，在505 nm处测定其吸光度，以吸光度为纵坐标、芸香苷对照品浓度（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线[13-14]，进行直线回归，回归方程为：y=12.831x+0.003 5，r=0.999 7。结果表明芸香苷在3.70～44.40 μg/mL范围内呈良好线性关系。endprint

2.2.4仪器精密度试验吸取对照品溶液2.0 mL于25 mL容量瓶中，按“2.2.3”节的方法显色，连续测定6次吸光度，RSD为0.18%，结果表明精密度较好。

2.2.5中间精密度试验吸取对照品溶液2.0 mL于25 mL容量瓶中，按“2.2.3”节的方法显色，分别在2台仪器上连续测定6次吸光度，RSD为1.68%、1.05%，中间精密度的RSD为2.07%，结果表明中间精密度较好。

2.2.6稳定性试验吸取2.0 mL供试品溶液于25 mL容量瓶中，按“2.2.3”节的方法分别于配制后0、1、2、4、6、8、24 h进行显色，测定吸光度，RSD为0.41%。按“2.2.3”的方法分别在显色后于0、5、10、15、20、25、30、35、40、60 min测定吸光度，RSD为1.61%，结果表明供试品溶液在24 h稳定性良好，显色后60 min稳定，满足测定要求。

2.2.7重复性试验取同一批号山刺玫果提取物6份，精确称量，按“2.2.1”节的方法制成供试品溶液，吸取2.0 mL于25 mL容量瓶中，按“2.2.3”节的方法显色，在505 nm处测定吸光度，RSD为 2.38%，结果表明重复性良好。

2.2.8加样回收率试验称取9份总黄酮含量已知的供试品，精确称定，每3份中加入3.18、6.34、9.52 mg/mL对照品溶液5.0 mL，按“2.2.1”节的方法制备供试品溶液，按“2.2.3”节的方法显色测定，结果见表1。

2.2.9样品含量测定称取5批供试品，精确称定，按“2.2.1”节的方法制备供试品溶液，按“2.2.3”节的方法显色，在505 nm处测定吸光度，结果显示5批山刺玫果提取物中总黄酮的含量分别为74.67%、73.00%、74.54%、7321%、75.80%。

2.3槲皮素含量测定

2.3.1对照品溶液的制备精确称取干燥至恒重的槲皮素对照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.20 mg/mL的槲皮素对照品溶液。

2.3.2供试品溶液的制备精确称取干燥的山刺玫果提取物0.16 g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇-25%盐酸溶液（4 ∶1）30 mL，密塞，称质量，置于90 ℃水浴中加热回流1 h，放冷，称重，用甲醇补充减失的质量，摇匀，过滤，将滤液转移至50 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度[15-16]，摇匀，吸取5 mL于25 mL容量瓶中，流动相定容，微孔滤膜（0. 45 μm） 过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.3.3色谱条件及适应性试验色谱柱为伊利特C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-水-磷酸-三乙胺（50 ∶50 ∶0.45 ∶0.2），流速为1.0 mL/min，检测波长为 374 nm，柱温为30 ℃，进样量为20 μL。在此条件下，槲皮素的保留时间为8.7 min，分离度为2.4，理论塔板数为5 100，其HPLC图如图2所示。

2.3.4标准曲线的绘制吸取对照品溶液适量，配成浓度分别为1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL的系列对照品溶液，分别进样20 μL，以槲皮素峰面积积分值y为纵坐标，进样量x（μg）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：y=3×106x-11 000，r=0.999 9。结果表明，槲皮素的进样量在0.02～0.20 μg 范围内呈良好的线性关系。

2.3.5重复性试验取同一批号山刺玫果提取物6份，按“2.3.1”节中已定的方法制备供试品溶液，各进样20 μL进行测定，结果显示槲皮素峰面积的RSD为1.68%，说明该方法具有良好的重复性。

2.3.6仪器精密度试验称取20 μg/mL的槲皮素对照品溶液，连续进样6次，每次进样20μL，结果显示槲皮素峰面

积的RSD为0.98%，说明仪器精密度良好。

2.3.7稳定性试验吸取供试品溶液，在同一色谱条件下，分别于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h进样20 μL，结果显示槲皮素的峰面积RSD为1.57%，说明供试品溶液在室温下8 h稳定。

2.3.8加样回收率试验称取9份槲皮素含量已知的供试品，每3份中分别加入0.20 mg/mL槲皮素对照品溶液1.50、1.88、2.25 mL，按“2.3.1”节的方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行含量测定，结果见表2。

2.3.9样品含量测定称取3批样品，精确称定，按“2.3.1”节中已定的方法制备供试品溶液，分别进样20 μL，测定槲皮素峰面积，计算其含量，结果3批样品中槲皮素的含量分别为0.221%、0.220%、0.224%。3结论与讨论

3.1薄层色谱条件的选择

3.1.1展开剂的选择分别以醋酸乙酯-甲酸-水（8 ∶1 ∶1、9 ∶1 ∶1、7 ∶1 ∶1、10 ∶1 ∶1、12 ∶1 ∶1、20 ∶1 ∶1）、甲醇-冰醋酸-水（4 ∶1 ∶5）、苯-醋酸乙酯-甲酸（5 ∶4 ∶1，6 ∶4 ∶1）、三氯甲烷-甲醇-水（28 ∶10 ∶1）为展开剂对展开系统进行比较，结果显示醋酸乙酯-甲酸-水（8 ∶1 ∶1）系统金丝桃苷比移值适中，斑点分离效果好。

3.1.2硅胶板的选择分别吸取供试品溶液3批、金丝桃苷对照品溶液及阴性对照溶液，分别考察自制硅胶G板（玻璃片基）、自制硅胶H板（玻璃片基）、层析硅胶（G）薄板（铝箔片基）、层析硅胶（G）薄板（玻璃片基）的展开效果，结果表明层析硅胶（G）薄板（铝箔片基）展开效果良好，荧光斑点清晰。

3.1.3显色剂的选择根据山刺玫果提取物的主要化学成分为黄酮类化合物，显色时选择9%FeCl3、5%AlCl3-乙醇溶液为显色剂进行显色，结果显示，5%AlCl3-乙醇溶液为显色剂，荧光斑点清晰，所以宜以5%AlCl3-乙醇溶液为显色剂。endprint

3.2 测定槲皮素含量的供试品溶液制备方法的确定

在槲皮素含量测定中，对供试品溶液制备方法进行研究，分别对水解液的用量、水解时间和水解温度进行探索。

3.2.1水解液用量的选择取6份干燥的山刺玫果提取物 0.16 g，精确称定，置于具塞锥形瓶中，分别加入甲醇-25%盐酸溶液（4 ∶1）10、15、20、25、30、35 mL，密塞，称质量，分别于50 ℃下进行水解，每次水解时间为0.5 h。放冷，称重，用甲醇补充减少的质量，摇匀，过滤，将滤液转移至50 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，吸取5 mL于25 mL容量瓶中，流动相定容，微孔滤膜（0.45 μm） 过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样20 μL，峰面积分别为27 146、28 147、30 009、34 359、34 479、33 380，根据峰面积选择水解液用量为30 mL。

3.2.2水解时间的选择取6份干燥的山刺玫果提取物 0.16 g，精确称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇-25%盐酸溶液（4 ∶1）30 mL，密塞，称质量，50 ℃进行水解，每次水解时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。按“3.2.1”节中的方法稀释过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样20 μL，峰面积为31 326、32 636、35 966、46 117、42 897、40 699，根据峰面积选择水解时间为2.0 h。

3.2.3水解温度的选择按“3.2.2”节中的方法称取提取物加入水解液，分别于50、60、70、80、90、100 ℃下进行水解，每次水解时间为2.0 h。按“3.2.1”节中的方法稀释过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样20 μL，峰面积分别为49 692、51 232、62 290、63 009、74 759、68 396，根据峰面积选择水解温度为90 ℃。

供试品溶液制备方法为：称取干燥的山刺玫果提取物0.16 g，精确称定，置于具塞锥形瓶中，加入水解液甲醇-25%盐酸溶液（4 ∶1）30 mL，90 ℃水解2.0 h。

本试验分别采用HPLC、UV法对山刺玫果提取物中槲皮素、总黄酮的含量测定进行了相关的探索，并建立了山刺玫果提取物的薄层鉴别方法，本试验建立的薄层鉴别方法斑点清晰、简便快捷，建立的含量测定方法专属性强、操作简便、线性关系良好，回收率、重现性符合要求，可以更全面地对山刺玫果提取物进行质量控制，为进一步开发山刺玫果提供了理论依据。endprint

3.2 测定槲皮素含量的供试品溶液制备方法的确定

在槲皮素含量测定中，对供试品溶液制备方法进行研究，分别对水解液的用量、水解时间和水解温度进行探索。

3.2.1水解液用量的选择取6份干燥的山刺玫果提取物 0.16 g，精确称定，置于具塞锥形瓶中，分别加入甲醇-25%盐酸溶液（4 ∶1）10、15、20、25、30、35 mL，密塞，称质量，分别于50 ℃下进行水解，每次水解时间为0.5 h。放冷，称重，用甲醇补充减少的质量，摇匀，过滤，将滤液转移至50 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，吸取5 mL于25 mL容量瓶中，流动相定容，微孔滤膜（0.45 μm） 过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样20 μL，峰面积分别为27 146、28 147、30 009、34 359、34 479、33 380，根据峰面积选择水解液用量为30 mL。

3.2.2水解时间的选择取6份干燥的山刺玫果提取物 0.16 g，精确称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇-25%盐酸溶液（4 ∶1）30 mL，密塞，称质量，50 ℃进行水解，每次水解时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。按“3.2.1”节中的方法稀释过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样20 μL，峰面积为31 326、32 636、35 966、46 117、42 897、40 699，根据峰面积选择水解时间为2.0 h。

3.2.3水解温度的选择按“3.2.2”节中的方法称取提取物加入水解液，分别于50、60、70、80、90、100 ℃下进行水解，每次水解时间为2.0 h。按“3.2.1”节中的方法稀释过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样20 μL，峰面积分别为49 692、51 232、62 290、63 009、74 759、68 396，根据峰面积选择水解温度为90 ℃。

供试品溶液制备方法为：称取干燥的山刺玫果提取物0.16 g，精确称定，置于具塞锥形瓶中，加入水解液甲醇-25%盐酸溶液（4 ∶1）30 mL，90 ℃水解2.0 h。

本试验分别采用HPLC、UV法对山刺玫果提取物中槲皮素、总黄酮的含量测定进行了相关的探索，并建立了山刺玫果提取物的薄层鉴别方法，本试验建立的薄层鉴别方法斑点清晰、简便快捷，建立的含量测定方法专属性强、操作简便、线性关系良好，回收率、重现性符合要求，可以更全面地对山刺玫果提取物进行质量控制，为进一步开发山刺玫果提供了理论依据。endprint

3.2 测定槲皮素含量的供试品溶液制备方法的确定

在槲皮素含量测定中，对供试品溶液制备方法进行研究，分别对水解液的用量、水解时间和水解温度进行探索。

3.2.1水解液用量的选择取6份干燥的山刺玫果提取物 0.16 g，精确称定，置于具塞锥形瓶中，分别加入甲醇-25%盐酸溶液（4 ∶1）10、15、20、25、30、35 mL，密塞，称质量，分别于50 ℃下进行水解，每次水解时间为0.5 h。放冷，称重，用甲醇补充减少的质量，摇匀，过滤，将滤液转移至50 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，吸取5 mL于25 mL容量瓶中，流动相定容，微孔滤膜（0.45 μm） 过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样20 μL，峰面积分别为27 146、28 147、30 009、34 359、34 479、33 380，根据峰面积选择水解液用量为30 mL。

3.2.2水解时间的选择取6份干燥的山刺玫果提取物 0.16 g，精确称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇-25%盐酸溶液（4 ∶1）30 mL，密塞，称质量，50 ℃进行水解，每次水解时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。按“3.2.1”节中的方法稀释过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样20 μL，峰面积为31 326、32 636、35 966、46 117、42 897、40 699，根据峰面积选择水解时间为2.0 h。

3.2.3水解温度的选择按“3.2.2”节中的方法称取提取物加入水解液，分别于50、60、70、80、90、100 ℃下进行水解，每次水解时间为2.0 h。按“3.2.1”节中的方法稀释过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样20 μL，峰面积分别为49 692、51 232、62 290、63 009、74 759、68 396，根据峰面积选择水解温度为90 ℃。

供试品溶液制备方法为：称取干燥的山刺玫果提取物0.16 g，精确称定，置于具塞锥形瓶中，加入水解液甲醇-25%盐酸溶液（4 ∶1）30 mL，90 ℃水解2.0 h。

本试验分别采用HPLC、UV法对山刺玫果提取物中槲皮素、总黄酮的含量测定进行了相关的探索，并建立了山刺玫果提取物的薄层鉴别方法，本试验建立的薄层鉴别方法斑点清晰、简便快捷，建立的含量测定方法专属性强、操作简便、线性关系良好，回收率、重现性符合要求，可以更全面地对山刺玫果提取物进行质量控制，为进一步开发山刺玫果提供了理论依据。endprint