陕南10种黑木耳主要栽培种酯酶同工酶的研究

摘要：以陕南10种主栽黑木耳品种的营养菌丝为材料进行酯酶（EST）同工酶的分析。结果表明，供试的黑木耳菌株酶带数为3～5条，且相对迁移率为0.615和0.510处的2条酶带10个菌株都具有，其相似性在0.375～1.000之间。应用NTSYS-pc软件进行聚类分析，耳91和耳268、耳238和耳913的相似性系数为1.000，表明其亲缘较近；耳801和耳238、耳913、国兴1号的相似性系数仅为0.375，表明耳801与其他3株菌种的亲缘性关系均较远。研究结果为陕南黑木耳的亲缘关系和遗传育种研究奠定了理论基础。

关键词：黑木耳；栽培种；酯酶同工酶；陕南

中图分类号： S646.603文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0193-04

收稿日期：2014-07-16

基金项目：陕西省科学技术研究发展计划（编号：2014K01-16-03）；陕西省科技统筹创新工程计划（编号：2012HBGC-20）。

作者简介：彭浩（1979—），男，陕西安康人，硕士，实验师，从事微生物学及仪器分析的相关教学科研工作。Tel：（0916）2641863；E-mail：penghaooo@snut.edu.cn。

通信作者：陈文强，教授，硕士生导师，从事微生物资源开发保护及利用相关研究。Tel：（0916）2642832；E-mail：wenqiangc@126.com。同工酶（isoenzyme）是具有相同或相近生物化学催化功能而酶蛋白质分子结构不同的一类酶[1-3]。同工酶蛋白分子构型的相似性可反映出生物种群间的亲缘关系，在进行种和种以下的分类时可以通过分析同工酶提供理论依据[4]。同工酶技术鉴定不同食用菌的方法与传统形态学方法相比具有很大的优势，首先是省时省力，其次是准确度高、操作简单[5-7]，在食用菌菌种鉴定和不同食用菌菌种间亲缘关系的研究、食用菌诱变育种、食用菌杂交和种质资源遗传图谱及连锁群识别中均有着重要的地位，在食用菌育种研究领域已被广泛应用[8-10]。近年来，国内胡国元等[11]、冯改静[12]、杨立红等[13]、张瑾等[14]分别以金针菇、平菇、香菇、白灵菇、灰树花等不同食用菌为研究材料，进行菌丝酯酶同工酶的研究，结果表明，酯酶同工酶标记是对食用菌进行遗传分析或生化鉴定中的最适标记手段之一。

黑木耳是我国传统的食用菌商品之一，已有2 000多年的人工种植历史。据统计，最近几十年，中国的黑木耳产量一直位居世界第一，是我国出口食用菌的主要产品。黑木耳也是地处秦岭腹地的陕南地区食用菌的主栽品种之一。近年来，在黑木耳种植过程当中，一些栽培品种出现不同程度的退化、老化和变异，导致黑木耳栽培性状和产量的不确定，主要表现在一些栽培菌株的生物学效率差别显著，口感和形态特征也有很大差异，这些由退化导致的因素严重损害了当地菇农的利益。研究人员发现，当原始菌株在连续传种传代10代后，其产量下降最多可达30%[15-16]。大多数种植区对黑木耳菌株管理存在很多缺陷，导致同一菌株被冠以不同的品种代号，造成菌种、品种混乱。因此，开展黑木耳种质资源研究，选育稳产高产的黑木耳菌株势在必行。

目前，陕南地区主栽黑木耳品种酯酶同工酶酶谱系统分析的相关研究报道甚少。本研究选取10株陕南地区栽培较为广泛的黑木耳为材料进行酯酶同工酶的分析。通过垂直板聚丙烯凝胶电泳，根据酯酶同工酶电泳谱图绘制模式图并分析酯酶同工酶的多样性，计算菌株之间的相似性系数并构建聚类分析图，分析菌株之间的亲缘关系，旨在对该地区主栽的黑木耳菌种进行亲缘关系的确定，以及为今后高产菌株的选育提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌种耳91、耳238、耳268、耳629、耳801、耳913、秦单3#、秦单4#、新科1号、国兴1号等10株菌株由陕西省食药用菌工程技术研究中心提供。

1.1.2主要仪器超净工作台（SW-CJ-IF型，苏州安泰生物科技公司），生化培养箱（5PX-250B5H-Ⅱ型，上海新苗生物科技有限公司），立式压力蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-50SⅡ型，上海博迅生物科技公司），电子天平（BSA8201型，北京赛多利斯生物科技公司），电泳仪（DY-11型，北京六一生物科技有限公司），扫描仪（V330E型，上海爱普生生物科技有限公司）。

1.1.3主要药品和试剂葡萄糖，琼脂，蛋白胨，75%乙醇，KH2PO4，MgSO4·7H2O，维生素B1，丙酮，36%醋酸，超纯水，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，坚牢蓝，α-乙酸萘酯，β-乙酸萘酯，蔗糖，阿魏酸。

1.1.4培养基CPDA培养基：去皮马铃薯20.0 g，葡萄糖 2.0 g，琼脂2.0 g，KH2PO4 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，维生素B1 1.0 mg，水100.0 mL，pH值自然。

样品制备液体培养基：洋葱20.0 g，蔗糖1.0 g，阿魏酸 6.0 mg，水100.0 mL，pH值自然。

1.2方法

1.2.1样品制备三角瓶分别装入样品制备液体培养基 80 mL，接入供试菌株菌丝，在生化培养箱中25 ℃下静置培养20 d。将静置培养20 d后的样品过滤，用纯净水反复多次冲洗菌丝体，用干净滤纸吸干水分。分别称取1.0 g黑木耳菌丝体分装于2.5 mL的离心管中，在4 ℃下8 000 r/min冷冻离心20 min，上清液弃掉。再往2.5 mL的离心管中加入 2.0 mL、pH值6.8的Tris-HCL缓冲液和1.0 g石英砂，在冰浴下研磨，再次在4 ℃下8 000 r/min冷冻离心20 min，取上清液置于4 ℃冰箱保藏，备用。

1.2.2电泳及染色采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法。浓缩胶浓度5.0%，分离胶浓度12.0%；电极缓冲液为Tris-Glycine系统，pH值8.3。上样量20 μL，溴酚蓝指示剂1滴，在样品上加1层10%的蔗糖；4 ℃下进行电泳；浓缩胶电压 80 V，分离胶电压120 V，电泳4 h左右。采用α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯和坚牢蓝染色，缓冲液为0.1 mol/L pH值6.2的磷酸缓冲液。电泳结束后把凝胶转移至配好的染色液中，25 ℃恒温条件下染色，当有褐色的酶带出现时，停止染色，用超纯水漂洗凝胶板。endprint

1.2.3数据记录和分析图像采集：将染色后的胶板平铺放置在扫描仪扫描仓内进行分别率为600 ppi的图片扫描。

绘制酯酶同工酶模式图：根据电泳谱图以酶带颜色和宽窄的差异，可将酶带分为4级：颜色深而且酶带宽的一级酶带，颜色较深而且酶带较宽的二级酶带，颜色较浅而且酶带较窄的三级酶带，颜色很浅而且酶带窄的四级酶带。对酶带进行分类并绘制酯酶同工酶模式图。

测量相对迁移率（Rf）：相对迁移率Rf=X/Y，X为点样孔下沿到指示剂前沿的迁移距离，Y为点样孔下沿到凝胶中酶带的迁移距离。用直尺测量Rf时，以酶带的中部位置为准。

酶谱之间相似性系数（S）分析：S=2Nab/（Na+Nb）。式中Nab为Rf 值相同的酶带数，Na和Nb分别为菌株a和菌株b各自的酶带数。当所比菌株的酶带数相同且全部为共有时，S=1；当所比物种没有一条共有酶带时，S=0。

聚类分析：根据凝胶在相同迁移率的位置上是否有条带进行分类，该位置上有酶带记为1，无酶带则记为0，并利用NTSYS-pc软件进行聚类分析。

2结果与分析

2.110种黑木耳菌株的营养菌丝酯酶同工酶酶谱分析

在分离胶浓度为12.0%、浓缩胶浓度为5.0%的电泳条件下对供试的10种黑木耳菌株的营养菌丝进行酯酶同工酶电泳，得到酯酶同工酶谱图（图1），依据酶谱中酶带的差异绘制酯酶同工酶模式图（图2）。

图1显示，供试10种黑木耳菌株的酯酶同工酶活性都比较高。电泳谱图中共出现36条酯酶同工酶谱带，每一菌株的酶带在2～5条之间，大多在3～5条之间。其中，耳629、耳801都出现5条酯酶同工酶谱带，耳238、耳913和国兴1号出现4条酯酶同工酶谱带，耳91、耳268、秦单3#、新科1号出现3条酯酶同工酶谱带，秦单4#最少，只有2条同工酶谱带。10个黑木耳菌株出现10个不同酶谱类型，没有相同的酶谱类型，其中耳91和耳268、耳238和耳913菌株的带型基本相似。10个供试菌株在Rf值0.615和0.510处都有2个共有酶带，这可能是黑木耳菌种的特征酶带。

图2显示，10种黑木耳菌株都共有1个二级酶带，耳629、国兴1号和新科1号的二级酶带最多，有2条；耳238、耳629和耳913不具有一级酶带，只有新科1号有2条一级酶带。

2.210种黑木耳菌株酯酶同工酶的Rf值比较

2.310种黑木耳菌株间酶谱聚类分析

2.3.110种黑木耳菌株酯酶同工酶酶谱相似系数（S）根据酶谱之间相似性系数（S）计算10种黑木耳菌株酯酶同工酶谱相似性系数（表2）。表210种黑木耳菌株酯酶同工酶酶谱的相似系数

菌株编号相似系数耳91耳238耳268耳629耳801耳913秦单3#秦单4#国兴1号新科1号耳911.000耳2380.8751.000耳2681.0000.8751.000耳6290.7500.8750.7501.000耳8010.5000.3750.5000.5001.000耳9130.8751.0000.8750.8750.3751.000秦单3#0.7500.6250.7500.5000.5000.6251.000秦单4#0.8750.7500.8750.6250.6250.7500.8751.000国兴1号0.6250.7500.6250.6250.3750.7500.8750.7501.000新科1号0.7500.6250.7500.7500.7500.6250.7500.8750.6251.000

表2显示，10种黑木耳菌株的遗传相似性系数在 0.375～1.000 之间，2个菌株间的相似系数越小，说明2个菌株亲缘关系较远。其中，耳801和耳238、耳913、国兴1号的相似程度最低，相似系数仅为0.375；耳801和耳91、耳268相似系数为0.500，表明它们的亲缘关系较远；而耳91和耳268、耳238和耳913的相似系数为1.000，说明它们可能是来自同一物种，甚至是亲缘关系密切的变异类型。

2.3.2聚类分析构建10种黑木耳菌株聚类分析图（图3），结果表明，耳91和耳268、耳238和耳913的相似性系数大，说明它们之间亲缘关系近；新科1号、秦单4#和秦单3#的

相似性系数较大，这3个菌株之间亲缘关系较近；耳238和耳629的相似性较大，说明这2个菌株之间亲缘关系比较近。耳801和耳238、耳913、国兴1号的相似程度最低，说明耳801和耳238、耳913、国兴1号的亲缘关系比较远，可作为黑木耳原生质体制备、融合及再生的优势菌株，这一结果可为陕南地区黑木耳的遗传育种奠定理论基础。

3讨论

本研究选用陕南10种黑木耳主栽菌株作为供试材料，经 20 d 静置液体培养后使酯酶同工酶的活性得到充分表达，通过对电泳条件进行试验，最终确定分离胶浓度12.0%、浓缩胶浓度5.0%为电泳凝胶的最佳条件。为防止电泳过程中产生的热量使样品中同工酶变性失活，需将电泳槽放置在4 ℃恒温环境下进行，确保试验的顺利和结果的准确性。

10种黑木耳菌株酯酶同工酶酶带的差异分析表明，耳801和耳913、耳238、国兴1号菌株酶谱的差异性较大，表明它们的亲缘关系较远；而耳91和耳268、耳238和耳913的酶谱具有一定的相似性，说明这4株菌中两两菌株之间的关系密切，这与相似性系数分析的结果一致。

酯酶同工酶既是通过基因来表达的，也是基因在分子水平上的体现，菌种间亲缘关系的远近可从菌株基因型的差异程度来反映。Vaughan在1968年提出种间亲缘关系可以用酶谱相似度进行预判，不同菌株之间的相似系数越大，表明物种间有着较小的酶谱差异，亲缘关系越近[17]，因此，对酯酶同工酶谱进行相似性系数分析是十分必要的。从酶谱相似系数表中可以看出，10种黑木耳菌株相似系数在0.375～1.000之间，相似系数达到0.625以上的菌株共7株，42对。其中耳91和耳268、耳238和耳913的相似系数为1.000，说明菌株间的遗传差异普遍存在于10种黑木耳菌株中，耳91和耳268、耳238和耳913可能源于同一种，甚至是亲缘关系更为密切的变异类型。endprint

通过对陕南主栽的10种黑木耳菌株的胞内酯酶同工酶进行垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析电泳谱图，计算菌株间的相似性系数，得出耳801和耳238、耳913、国兴1号的亲缘性关系较远，可作为原生质体制备、融合及再生的优势菌株，这可为陕南当地高产优质的黑木耳品种的遗传育种奠定理论基础。

参考文献：

[1]胡能书，万国贤. 同工酶技术及应用[M]. 长沙：湖南科学技术出版社，1985：149-181.

[2]陈惠黎，李文杰. 分子酶学[M]. 北京：人民卫生出版社，1983：368-370.

[3]傅四清，魏蓉城. 同功酶技术在真菌分类中的应用[J]. 中国食用菌，1998，17（1）：8-9.

[4]方丁，房世荣. 同工酶在医学上的应用[M]. 北京：人民卫生出版社，1982：96-165.

[5]李迅，胡沂淮，裴建军，等. 分子生物学技术在担子菌中的研究进展[J]. 中国食用菌，2003，22（4）：6-8，42.

[6]张树庭，林芳灿. 蕈菌遗传与育种[M]. 北京：中国农业出版社，1997：9-11.

[7]梁建光，杨立红，王晓洁，等. 不同条件对食用菌酯酶同工酶谱多态性的影响[J]. 西南农业大学学报：自然科学版，2005，27（4）：500-504.

[8]唐利华，郭倩，王瑞娟，等. 中国黑木耳主要栽培菌株酯酶同工酶的研究[J]. 食用菌学报，2007，14（4）：37-40.

[9]边银丙，罗信昌，周启. 木耳栽培菌株酯酶同工酶的酶谱多样性研究[J]. 菌物系统，2000，19（1）：87-90.

[10]张红梅，吕长武，吕杰，等. 同工酶技术在食用菌育种研究中的应用[J]. 种子，2007，26（7）：44-47.

[11]胡国元，朱兰宝，周玉麟. 金针菇品系间酯酶同工酶标记筛选研究[J]. 生物学杂志，1999，16（1）：14-15，31.

[12]冯改静. 白灵菇亲本筛选与紫外线诱变、杂交及杂种优势预测[D]. 保定：河北农业大学，2006.

[13]杨立红，黄清荣，刘新海，等. 食用菌菌种纯度的酯酶同工酶电泳测定[J]. 西南农业大学学报：自然科学版，2005，27（1）：128-131，135.

[14]张瑾，华秀英，王海英，等. 13个香菇品种间酯酶同工酶的研究[J]. 沈阳师范学院学报：自然科学版，2000，18（4）：35-39.

[15]吕玉珍，丁娟芳，韦林洪，等. 野生黑木耳菌株的选育及其评价[J]. 食用菌，2010，32（5）：20-22.

[16]张金霞，谢宝贵. 食用菌菌种生产与管理手册[M]. 北京：中国农业出版社，2006：18-76.

[17]Vaughan J E. An acrylamide gel electrophoretic study of the seed proteins of Brassica，Sinapsis species with special reference to their taxonomic value[J]. Journal of Experimental Botany，1968，19：724-732.管卫兵，王丽. 陆基生态渔场的概念、理论与实践[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：197-200.endprint

通过对陕南主栽的10种黑木耳菌株的胞内酯酶同工酶进行垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析电泳谱图，计算菌株间的相似性系数，得出耳801和耳238、耳913、国兴1号的亲缘性关系较远，可作为原生质体制备、融合及再生的优势菌株，这可为陕南当地高产优质的黑木耳品种的遗传育种奠定理论基础。

参考文献：

[1]胡能书，万国贤. 同工酶技术及应用[M]. 长沙：湖南科学技术出版社，1985：149-181.

[2]陈惠黎，李文杰. 分子酶学[M]. 北京：人民卫生出版社，1983：368-370.

[3]傅四清，魏蓉城. 同功酶技术在真菌分类中的应用[J]. 中国食用菌，1998，17（1）：8-9.

[4]方丁，房世荣. 同工酶在医学上的应用[M]. 北京：人民卫生出版社，1982：96-165.

[5]李迅，胡沂淮，裴建军，等. 分子生物学技术在担子菌中的研究进展[J]. 中国食用菌，2003，22（4）：6-8，42.

[6]张树庭，林芳灿. 蕈菌遗传与育种[M]. 北京：中国农业出版社，1997：9-11.

[7]梁建光，杨立红，王晓洁，等. 不同条件对食用菌酯酶同工酶谱多态性的影响[J]. 西南农业大学学报：自然科学版，2005，27（4）：500-504.

[8]唐利华，郭倩，王瑞娟，等. 中国黑木耳主要栽培菌株酯酶同工酶的研究[J]. 食用菌学报，2007，14（4）：37-40.

[9]边银丙，罗信昌，周启. 木耳栽培菌株酯酶同工酶的酶谱多样性研究[J]. 菌物系统，2000，19（1）：87-90.

[10]张红梅，吕长武，吕杰，等. 同工酶技术在食用菌育种研究中的应用[J]. 种子，2007，26（7）：44-47.

[11]胡国元，朱兰宝，周玉麟. 金针菇品系间酯酶同工酶标记筛选研究[J]. 生物学杂志，1999，16（1）：14-15，31.

[12]冯改静. 白灵菇亲本筛选与紫外线诱变、杂交及杂种优势预测[D]. 保定：河北农业大学，2006.

[13]杨立红，黄清荣，刘新海，等. 食用菌菌种纯度的酯酶同工酶电泳测定[J]. 西南农业大学学报：自然科学版，2005，27（1）：128-131，135.

[14]张瑾，华秀英，王海英，等. 13个香菇品种间酯酶同工酶的研究[J]. 沈阳师范学院学报：自然科学版，2000，18（4）：35-39.

[15]吕玉珍，丁娟芳，韦林洪，等. 野生黑木耳菌株的选育及其评价[J]. 食用菌，2010，32（5）：20-22.

[16]张金霞，谢宝贵. 食用菌菌种生产与管理手册[M]. 北京：中国农业出版社，2006：18-76.

[17]Vaughan J E. An acrylamide gel electrophoretic study of the seed proteins of Brassica，Sinapsis species with special reference to their taxonomic value[J]. Journal of Experimental Botany，1968，19：724-732.管卫兵，王丽. 陆基生态渔场的概念、理论与实践[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：197-200.endprint

通过对陕南主栽的10种黑木耳菌株的胞内酯酶同工酶进行垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析电泳谱图，计算菌株间的相似性系数，得出耳801和耳238、耳913、国兴1号的亲缘性关系较远，可作为原生质体制备、融合及再生的优势菌株，这可为陕南当地高产优质的黑木耳品种的遗传育种奠定理论基础。

参考文献：

[1]胡能书，万国贤. 同工酶技术及应用[M]. 长沙：湖南科学技术出版社，1985：149-181.

[2]陈惠黎，李文杰. 分子酶学[M]. 北京：人民卫生出版社，1983：368-370.

[3]傅四清，魏蓉城. 同功酶技术在真菌分类中的应用[J]. 中国食用菌，1998，17（1）：8-9.

[4]方丁，房世荣. 同工酶在医学上的应用[M]. 北京：人民卫生出版社，1982：96-165.

[5]李迅，胡沂淮，裴建军，等. 分子生物学技术在担子菌中的研究进展[J]. 中国食用菌，2003，22（4）：6-8，42.

[6]张树庭，林芳灿. 蕈菌遗传与育种[M]. 北京：中国农业出版社，1997：9-11.

[7]梁建光，杨立红，王晓洁，等. 不同条件对食用菌酯酶同工酶谱多态性的影响[J]. 西南农业大学学报：自然科学版，2005，27（4）：500-504.

[8]唐利华，郭倩，王瑞娟，等. 中国黑木耳主要栽培菌株酯酶同工酶的研究[J]. 食用菌学报，2007，14（4）：37-40.

[9]边银丙，罗信昌，周启. 木耳栽培菌株酯酶同工酶的酶谱多样性研究[J]. 菌物系统，2000，19（1）：87-90.

[10]张红梅，吕长武，吕杰，等. 同工酶技术在食用菌育种研究中的应用[J]. 种子，2007，26（7）：44-47.

[11]胡国元，朱兰宝，周玉麟. 金针菇品系间酯酶同工酶标记筛选研究[J]. 生物学杂志，1999，16（1）：14-15，31.

[12]冯改静. 白灵菇亲本筛选与紫外线诱变、杂交及杂种优势预测[D]. 保定：河北农业大学，2006.

[13]杨立红，黄清荣，刘新海，等. 食用菌菌种纯度的酯酶同工酶电泳测定[J]. 西南农业大学学报：自然科学版，2005，27（1）：128-131，135.

[14]张瑾，华秀英，王海英，等. 13个香菇品种间酯酶同工酶的研究[J]. 沈阳师范学院学报：自然科学版，2000，18（4）：35-39.

[15]吕玉珍，丁娟芳，韦林洪，等. 野生黑木耳菌株的选育及其评价[J]. 食用菌，2010，32（5）：20-22.

[16]张金霞，谢宝贵. 食用菌菌种生产与管理手册[M]. 北京：中国农业出版社，2006：18-76.

[17]Vaughan J E. An acrylamide gel electrophoretic study of the seed proteins of Brassica，Sinapsis species with special reference to their taxonomic value[J]. Journal of Experimental Botany，1968，19：724-732.管卫兵，王丽. 陆基生态渔场的概念、理论与实践[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：197-200.endprint