猪繁殖与呼吸综合征病毒XINX株的分离及NSP2基因的遗传进化分析

摘要：为了了解猪繁殖与呼吸综合征病毒在河南地区猪体内的进化情况，笔者采集了河南新乡地区出现的疑似猪繁殖与呼吸综合征的流产猪胎，并进行了病毒的分离鉴定，同时对分离病毒株的NSP2基因部分序列进行遗传进化分析。结果共分离并鉴定出1株美洲型猪繁殖与呼吸病毒XINX，且NSP2基因部分序列的分析显示，该毒株与以往的分离毒株不同，其NSP2基因存在393 bp的不连续缺失，同国内之前报道的经典毒株和高致病性毒株间均存在较大差异，目前在国内尚数首次出现。研究结果为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子进化提供了重要信息。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；Marc-145；NSP2；遗传进化分析

中图分类号： S855.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0180-03

收稿日期：2013-11-15

基金项目：国家农业科技成果转化资金（编号：30500254）。

作者简介：周峰（1988—），男，河南固始人，硕士研究生，主要研究方向为分子病原学。E-mail：290679317@qq.com。

通信作者：杨霞，副教授，研究方向为分子病原学。E-mail：yangxia66@163.com。猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种猪的重要传染病，该病以怀孕母猪流产、早产和死胎以及仔猪和育肥猪发生呼吸道疾病为主要特征。PRRS于1987年在美国首次被发现，现已波及全球，给世界养猪业造成了巨大经济损失[1-2]。我国于1996年首次在流产的猪胎中分离到PRRSV，并相继发现了多种变异毒株[3-5]。目前，PRRSV主要包括以Lelystad virus（LV）为代表的欧洲型（type1，European type）和以VR-2332为代表株的北美洲型（type2，North American type）2种基因型，在中国主要流行美洲型。PRRSV病毒基因组为单股正链RNA，全长约为15 kb，包括10个开放阅读框（ORFs）和2个非编码区（UTRs）[6]。ORF1a、ORF1b大约占了病毒基因组的80%，分别编码pp1a、pp1ab这2个复制多聚蛋白，并最终被ORF1a编码的蛋白水解酶切割成14个非结构蛋白（non-structure protein，NSP）[7-8]；ORF2a、ORF2b分别编码病毒的结构蛋白GP2a、GP2b；ORFs3-7分别编码病毒的结构蛋白GP3、GP4、GP5、M、N蛋白[9]。研究表明，NSP2是PRRSV基因组中最容易发生变异的基因[10]，高致病性PRRSV（HP-PRRSV）的NSP2基因在第482位和第533～561位缺失30个不连续的氨基酸[11-14]，这些缺失可能与2006年中国出现的HP-PRRSV的毒力有关。基于这个原因，NSP2已经成为PRRSV流行病学调查和系统进化分析中的一个重要标记[14]。本研究首先采集疑似病料并进行病毒的分离鉴定；然后在NSP2基因序列测定与分析的基础上证实，所分离毒株为PRRSV变异株，将其命名为XINX。研究结果为防控河南新乡地区PRRS的发生及进一步开展该病毒分子流行规律、遗传变异及疫苗研制等提供了理论支持。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1样品试验样品为2012年采自河南新乡地区某猪场疑似PRRS的流产猪胎，样品置于-70 ℃保存备用。

1.1.2试剂Marc-145细胞，河南农业大学牧医工程学院传染病实验室保存；胎牛血清，购自北京四季青公司；Taq DNA聚合酶、鼠源反转录酶（M-MLV）、RNA酶抑制剂（Rnase Inhitor）、dNTP、pMD18-T载体，购自大连宝生物工程有限公司；DEPC，购自Amresco公司；Trizol Reagent，购自Invitrogen公司；琼脂糖，购自Sigma公司。

1.1.3引物参考PRRSV VR2332株（GenBank登录号EF536003）和JXA1（GenBank登录号EF112445）NSP2全基因序列，应用Primer5.0软件设计针对NSP2高变区的特异性引物，详见表1。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表1PRRSV NSP2基因扩增引物

引物名称及序列（5′→3′）扩增区域目的基因片段长度（bp）NSP2-F：ACCCTTCCYGAAAGAGTRAG；NSP2-R：CCTCATATTCMGTCTGTGAGGAHGC1388～2915NSP21 528左右

1.2试验方法

1.2.1病毒分离取适量流产猪胎的脾、肺、淋巴结，剪碎后用PBS稀释后研磨，冻融3次，8 000 r/min离心10 min后取上清，经0.22 μm微孔滤膜过滤，分装后于-70 ℃保存备用。取单层铺满90%的Marc-145细胞，用上述处理的病料接种细胞，37 ℃吸附1 h后，加入含有2%胎牛血清的维持液，于37 ℃ CO2细胞培养箱中培养， 若无典型细胞病变（CPE），则根据细胞培养状态在接毒后4～5 d进行收毒，继续盲传直至出现典型的PRRSV CPE。当CPE达到80%左右时进行收毒，于-20 ℃经3次反复冻融后，8 000 r/min室温离心 2 min，取上清按上述方法继续接种到Marc-145细胞进行病毒传代。

1.2.2病毒液RNA的提取取上清参照Trizol reagent说明书进行操作，所提取基因组RNA用30 μL 1‰ DEPC水溶解，-70 ℃保存备用。endprint

1.2.3PRRSVNSP2基因RT-PCR扩增与测序。提取上述部分阳性样品中的总RNA，以20 μL体系进行反转录：13 μL RNA模板，4 μL 5×buffer，1 μL dNTP（10 mmol/μL），1 μL 随机引物（20 pmol/μL），0.5 μL RNA酶抑制剂（40 U/μL），0.5 μL反转录酶M-MLV （200 U/μL）。反应条件：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，将得到的cDNA用于PCR扩增。

PCR按50 μL反应体系进行：5 μL 10×buffer，5 μL MgCl2 （25mmol/μL），5 μL反转录产物（cDNA），1 μL dNTP（10 mmol/μL），0.5 μL Taq DNA聚合酶，各1 μL上下游引物，补加灭菌双蒸水至50 μL。反应循环参数：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共32个循环；72 ℃ 10 min。反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，经连接转化后，将阳性克隆送北京华大基因公司测序。

1.2.4序列分析所得序列经过NCBI网站上的BLAST比对后，运用DNAStar中的MegAlign将测序结果与参考毒株（表2）的NSP2基因进行序列比对和同源性分析。

2结果与分析

2.1病毒分离

将病料滤液接种到Marc-145细胞上，盲传至第7代时，可产生稳定、典型的PRRSV细胞病变（CPE），即接毒48 h左右可见少量轻微的细胞聚集，72 h左右有大量的细胞聚集成堆，80%以上细胞出现明显CPE（图1）。

2.2PRRSV NSP2基因部分序列的鉴定

以病变细胞悬液总RNA为模板，经RT-PCR扩增获得1条比1 528 bp低400 bp左右的DNA片段（图2）。将PCR产物经胶回收、连接、转化后，提取阳性质粒送北京华大基因公司测序，测序结果显示，扩增片段大小为1 124 bp。目前序列已提交至GeneBank，登录号为KF000084。

2.3NSP2基因部分序列分析

在美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站的BLAST结果显示，NSP2与国外流行毒株NADC30的核苷酸序列相似性最高。用DNAstar中的MegAlign进行序列比对和同源性分析，结果表明，与经典毒株VR2332比较，XINX分别在第964～1 296、1 452～1 454、1 515～1 571位共计缺失393个核苷酸。NSP2与经典毒株参考毒株VR2332、BJ-4、CH-2a的核苷酸序列相似性为67.6%，与HP-PRRSV参考毒株

JXA1、TJ、HUN4、HEB1、09HEN1的核苷酸序列相似性为638%～644%，与欧洲型参考毒株Lelystad virus核苷酸序列的相似性为45.6%；而与国外流行毒株NADC30核苷酸序列相似性最高，为95.2%。利用Mega 4.0中的邻接法（Neighbor-Joining；bootstrap values of 1000 replicates）对NSP2基因推导的氨基酸序列进行遗传进化分析，结果表明，XINX与美洲型PRRSV处于同一大分支，但是既不与经典毒株处于同一分支，又与HP-PRRSV的亲缘关系相差较远，而是与国外流行毒株NADC30处于同一进化分支（图3）。

3结论

PRRS是一种对世界养猪业都具有重大影响的猪传染性疾病，它能够引起怀孕母猪流产和新生仔猪的呼吸道疾病。该病于1987年在美国和加拿大首次被发现，随后在日本、德国以及其他国家相继被发现。我国于1995年首次发现该病，并导致了重大经济损失。2006年春季，在我国东部地区暴发了一场以高发病率和高死亡率为特点的PRRS，随后开始向全国蔓延。近些年来，PRRS对河南省养猪业也造成了巨大的经济损失，因此对PRRSV进行严密监视显得尤为重要。

NSP2基因作为PRRSV整个基因组中最容易变异的区域，具有明显的多样性，它在同一基因型中和不同基因型之间的变异都很大，且具有很高的耐缺失和插入的能力；此外，由于NSP2的蛋白酶活性，使其能在调节宿主免疫和病毒复制方面具有至关重要的作用。因此NSP2常常作为监视PRRSV变异的重要标记。

PRRSV XINX分离株是从河南省新乡地区某县养猪场疑似PRRS引起的流产猪胎中分离出来的，NSP2基因序列比对结果表明，该毒株既不属于经典毒株，又与HP-PRRSV有很大差别，而与国外流行毒株NADC30序列相似性却很高，其393个核苷酸的缺失在国内也属首次出现。表明有新的PRRSV缺失毒株在我国出现，且有外来毒株的可能性，提示需要进一步加强对于猪及其相关产品的入境检疫。此外，通过了解和持续监测发现，免疫活疫苗的该猪场，经典的PRRSV和以缺失30个氨基酸为特点的HP-PRRSV检出率很低，而XINX毒株的阳性率却很高，提示该病毒可能通过某种途径逃避宿主免疫监视，但该缺失变异是否与毒株的毒力、生长特性等生物学特征相关，尚需进一步深入研究。

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