猪流感病毒分子检测技术研究进展

张文慧　李雪娇　钱爱东

摘要：猪流感是由猪流感病毒引起的一种急性、高度接触传染性猪传染病，对养猪业危害极大。猪流感病毒也可感染人类，对人类的生命健康造成威胁。对猪流感病毒的分子检测技术及我国猪流感的流行现状进行了综述。

关键词：猪流感；流行现状；分子检测

中图分类号： S858.28；S852.65+1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0059-02

收稿日期：2013-12-09

基金项目：国家科技支撑计划（编号：2012BAD04B01-5）。

作者简介：张文慧（1977—），女，吉林桦甸人，博士，副教授，从事微生物学研究。E-mail：215267612@qq.com。

通信作者：钱爱东，从事微生物学研究。Tel：（0431）84533426；E-mail：qianaidongO115@163.com。猪流感（swine influenza，SI）是由猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）引起的一种急性、高度接触传染性猪传染病。1918年，美国首次报道了SI。1930年，Shope分离并鉴定了第一株猪流感病毒SIV A/Swine/Iowa/15/30（H1N1），该病毒被认为是美国20世纪初发生的SI病原[1]。该病传播迅速，往往2～3 d内波及全群。康复猪、隐性感染猪是猪流感病毒的主要储存宿主，也是猪流感的主要传染源[2]。该病一年四季都可发生，在规模化养猪场难以根除，对养猪业危害极大。另外，SIV的HA受体结合位点具有与人流感病毒、禽流感病毒2种流感病毒受体相同的结合特异性，这决定了SIV不仅可以感染猪，同时也可感染人类[3]。历史上SIV感染人的报道并不罕见。1976年美国新泽西州一名士兵死于古典H1N1 SIV感染，这是人类历史上首例SIV致死人的报道，之后在其他地区也出现SIV感染人并致死的报告[4-5]。迄今为止，猪流感已遍及世界各地，已经分离出H1N1、H1N2、 H2N3、H3N1、H1N7、H3N3、H4N6、H5N1等多种血清型，其中在猪群中广泛流行的猪流感病毒主要有古典猪H1N1毒株、类禽H1N1毒株、类人H3N2毒株[6]。本研究对猪流感病毒的分子检测技术以及猪流感在我国的流行现状进行综述，旨在为开展猪流感研究提供参考。

1猪流感病毒分子检测技术研究进展

1.1反转录聚合酶链式反应

反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是目前发展最成熟的分子诊断技术，可以从基因水平检测SIV的RNA，大大缩短了SI病原的检出时间，为猪流感的快速诊断提供了更敏感、更快速的方法。该方法具有省时、省力、灵敏度高、特异性强、诊断速度快等优点，已在猪流感病毒检测中得到广泛应用[7]。Lee等利用RT-PCR方法分别在临床样本中鉴定出H1、H3、N1、N2亚型猪流感病毒[8]。杨焕良等建立了猪流感病毒H1N1、H1N2、H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法，可以在2个反应体系中对猪流感HA、NA基因进行亚型鉴定，极大地节约了人力与时间[9]。特异性试验检测多重RT-PCR不能扩增其他猪病毒核酸，核酸最低检测量达2 ng。

1.2实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（real-tmie flurescent quantitive polymerase chain reaction）是将荧光基团加入PCR反应体系中，利用荧光信号积累对整个PCR进程进行实时监测，敏感性远远高于普通的RT-PCR。实时PCR/RT-PCR技术是将PCR、核酸杂交、信号放大相结合的实时、在线检测的定量PCR技术，比常规PCR更灵敏、特异性更强。目前已被广泛应用于基因表达研究、转基因研究、药物疗效分析、病原体检测等诸多领域。此方法已被用于A型、B型流感病毒检测，检测流感病毒的M 基因、HA基因来区别A型、B型流感病毒，或是用于区别A型流感病毒的亚型[10-11]。段廷云等建立了实时荧光定量PCR检测H1N1亚型猪流感病毒，以NP基因的阳性重组质粒为荧光定量PCR标准品模板建立标准曲线。对探针浓度、引物浓度、镁离子浓度、退火温度进行优化，建立最佳荧光定量PCR反应体系、扩增程序[12]。荧光定量PCR的建立为早期诊断猪流感病毒、定量分析猪流感病毒感染程度奠定了基础。张太翔等选取猪流感病毒的NP基因序列设计引物、探针，建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法[13]。张鹏超等建立的猪流感病毒SYBR Green Ⅰ定量RT-PCR 检测方法对SIV核酸检测灵敏度达30 TCID[14]。陈艳等建立了H3N2亚型猪流感病毒实时荧光定量PCR快速检测方法[15]。徐敏等建立了以RNA为反应模板的一步法荧光定量RT-PCR诊断方法，该方法操作简单，可以用RNA作为模板直接检测，节省时间，特异性好，灵敏度高[16]。张春明等根据猪流感病毒（SIV） M 基因的保守序列，设计并合成1对特异性引物及TaqMan MGB 探针，建立了SIV M 基因实时荧光定量PCR 检测方法，结果表明，该方法样品检测与病毒滴定及病毒分离结果的符合率均达到100%，特异性强，重复性好[17]。Real-Time PCR技术能精确检测样品中SIV的含量，对SI临床检测诊断具有较强的实用价值[18]。

1.3基因芯片

基因芯片技术指将大量探针分子固定于支持物后，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号强度而获取样品分子的数量、序列信息。通过设计不同的探针阵列，使用特定的分析方法，可将该技术用于基因表达检测、突变检测、多态性分析、基因文库作图、杂交测序、微生物检测等领域[19]。陈红军等根据流感病毒血凝素、神经氨酸酶、亚型基因序列间的差异性，分别设计H1、H3、H9、N1、N2的特异分型引物，根据M基因设计A型流感病毒的通用引物制成基因芯片，并对217 份不同地区的样品进行检测，结果表明，该芯片可以同时检测待检样品中5种亚型A型流感病毒，并显示了较高的灵敏度、特异性，灵敏度比PCR 高1个稀释度，比病毒分离高2个稀释度[20]。杨林等根据猪流感病毒的M基因序列设计了1对特异性引物，通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对SIV的检测[21]。高淑霞等制备了检测H1N1、H3N2、H5N1、H9N2 4种亚型猪流感病毒的基因芯片技术，与PCR方法相比，该基因芯片技术显示了较高的灵敏度[22]。王慧煜等建立了能同时鉴别甲型H1N1及猪流感病毒常见亚型的新型基因芯片检测方法[23]。

2我国猪流感流行现状

近年来，我国很多学者分离到不同亚型的SIV[24]。李海燕等对黑龙江省、吉林省、辽宁省等地猪群进行了猪流感血清学、病原学调查研究，从1 306份猪鼻棉拭子样品及死亡猪肺、气管样品中分离到39株H3N2 亚型猪流感病毒、12株H1亚型猪流感病毒及其他亚型猪流感病毒[25]。辛晓光等进行了黑龙江省猪流感病原学及血清学调查，1997—2002年共采集到414份猪血清样品，经猪流感血清学检查出猪流感阳性血清57份，平均阳性率为14%；采集到猪的病毒材料275例，经技术处理后接鸡胚，分离出猪流感病毒26株，表明有些猪场污染情况比较严重，直接影响猪场的生存及发展[26]。王隆柏等于2005年8—12月对福建省猪群猪流感病毒感染情况进行调查，猪流感H1亚型抗体检测的平均阳性率为530%，猪流感H3亚型抗体检测的平均阳性率为23.7%，由此可知，福建省猪群不仅存在不同程度的H1、H3亚型SIV感染，而且感染较为普遍[27]。康文彪等在甘肃省11个市州的猪群中检出猪流感H3N2抗体阳性118份，平均阳性率为2789%，其中健康猪血清检出阳性42份，阳性率为2234%；患病猪血清检出阳性76份，阳性率为32.34%[28]。朱善德等对浙江省宁波市10个县（市、区）5个猪场的457份血清进行猪流感H3N2抗体检测，结果表明，猪场阳性率为2593%，全市猪群平均阳性率为16.41%；检测健康猪血清373份，阳性率达11%；检测发病猪血清84份，阳性率达4048%[29]。姚敬明等2010年6月至2011年11月在山西省采集了1 018份血样，用ELISA试剂盒检测猪流感血清抗体，阳性率为0.98%[30]。禹思宇等2010年6月采用间接ELISA及实时荧光RT-PCR技术，对湖南省规模化猪场采集的 1 065 份猪血清、16 796份猪棉拭子、360份肺脏样品进行检测，结果显示，SIV H1N1抗体阳性率达37.84%，H1N1猪流感病毒抗原阳性率为0.12%[31]。由此可知，SIV在我国不同地区均呈现地方性流行趋势，猪群普遍受H1亚型、H3亚型SIV感染。

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