水稻种子酵母双杂交体系的构建及种子特异表达蛋白ONAC023互作蛋白的鉴定

唐立群++黄世文++侯雨萱

摘要：酵母双杂交是常用的蛋白-蛋白检测技术。以水稻受精5 d的幼嫩种子为材料，构建了适用于水稻种子发育相关蛋白的互作蛋白酵母双杂交筛选平台，cDNA文库容量达到1.1×106，平均插入大小约为750 bp，开发了改良的酵母菌落PCR方法，用于文库插入片段的扩增，大大提高了筛选效率。NAC是植物特有的一类转录因子，在植物发育、抗逆等多个方面发挥着重要功能。RT-PCR结果显示，NAC家族成员ONAC023在种子中特异表达，可能调控种子早期发育。以ONAC023为诱饵，成功地筛选到21个互作蛋白候选基因，其中包含1个DNA linding protein，推测其可能是ONAC023蛋白复合物的成员。

关键词：水稻；酵母双杂交；种子发育；NAC

中图分类号： S511.035.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0016-04

收稿日期：2014-05-07

基金项目：国家科技支撑计划（编号：2012BAD19B03）；国家转基因生物新品种培育专项（编号：2011ZX08010-005）；中国农业科学院科技创新工程。

作者简介：唐立群（1987—），女，湖南东安人，硕士，从事水稻基因功能研究。E-mail：liquntang2013@126.com 。

通信作者：候雨萱，博士，助理研究员，从事水稻基因功能研究。E-mail：houyuxuan@caas.cn。真核生物中的大部分蛋白都是以复合物的形式存在并工作。一些蛋白在不同的生长发育时期通过与不同的蛋白互作，形成蛋白复合物来行使不同的生物学功能，从而保证生物体高效运行。研究蛋白-蛋白之间的互作，进而找出功能蛋白复合物的其他成员，一直是生物学研究的重要内容。目前，常用的研究蛋白-蛋白互作的方法有酵母双杂交、免疫共沉淀、GST pull-down、双分子荧光互补等技术，其中以酵母双杂交方法应用最为广泛。 酵母双杂交技术最早于1989年由Fields提出，其基本原理是酵母转录因子GAL4具有BD、AD 2个结构域，BD与AD单独作用并不能激活转录反应，但当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。因此，将要检测互作的2个蛋白分别与BD、AD融合表达，当这2个蛋白存在互作时，BD才能与AD在空间上靠近，进而激活下游报告筛选基因的表达。相比其他蛋白互作检测技术，酵母双杂交具有众多优点：快速高效，无需提取或纯化目标蛋白质；在酵母活体内进行，一定程度上代表了真核生物细胞的活体状态；检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。此外，通过构建所需组织器官的酵母双杂交筛选文库，研究人员可以一次性筛选多个与“诱饵”互作的蛋白 。目前，已有大量的商业化酵母双杂交系统试剂盒可供选择，其中Clontech公司最新的Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System因具有高效、简单、易操作的特点而被广泛使用。这一体系运用该公司特有的SMART cDNA合成技术在合成的cDNA两端添加重组位点接头，然后将合成的cDNA与线性化的载体共转化到酵母菌株Y187中完成体内重组，得到酵母双杂交cDNA文库。该体系的另一个特点是利用酵母不同菌株的交配（mating）技术来筛选文库，操作简单易行。Kanneganti等在研究水稻基因家族与胁迫相关的蛋白基因OsiSAP8功能时，发现其功能由A20、AN1这2个锌指域相互作用而对水稻生理功能进行调控[1]。Menke等运用酵母双杂法研究烟草转录因子WRKY1功能，结果表明，其与烟草HR-like细胞的死亡密切相关[2]。崔红军等在研究玉米的根部基因功能时也提及了这一技术[3]。转录因子是一群能与基因5′端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。转录因子依据结构域的保守性可区分为数百个不同的家族，在生物体的生长发育过程中起着重要的调控作用。NAM、ATAF、CUC （NAC）类转录因子是一类植物特有的家族，其所有成员在N端都含有1个保守的DNA结合结构域，在C端则各不相同[4-7]。目前，关于NAC转录因子的功能研究已有大量报道[8-9]。Zhu等研究发现，番茄的SINAC4调控果实的成熟及类胡萝卜素的沉积[10]。Hu等发现，SNAC1可以通过调控水稻保卫细胞的闭合来提高植株的耐旱性，可能是干旱反应的关键调控因子[11]。过量表达SNAC1还能提升小麦、棉花的抗逆性[12]。水稻是我国主要的粮食作物，开展水稻基因功能研究，了解水稻内部各个基因、基因与外界的互作关系，对于保障国家粮食安全意义重大。本研究利用改良的种子RNA提取方法得到高质量的总RNA，采用Make Your Own“Mate & PlateTM” Library System建立来源于水稻种子的酵母双杂交体系，成功筛选到1个种子中特异表达的NAC转录因子ONAC023的互作蛋白。

1材料与方法

1.1材料

水稻品种日本晴种植于中国水稻研究所试验田，取受精 5 d 的种子作为材料。酵母菌株Y187与Y2HGold以及载体pGBKT7、pGADT7-Rec、Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System、YeastmakerTM Yeast Transformation System 2均购自Clontech 公司。RNA提取试剂Trizol购自上海鼎国生物技术有限公司。

1.2RNA的提取和反转录

取自然受精5 d的种子，采用SDS-Trizol法抽提总RNA，简要步骤如下：将200 mg种子材料置于1.5 mL离心管中，加300 μL SDS RNA extraction buffer （50 mmol/L pH值为8.0 Tris-HCl，150 mmol/L LiCl，5 mmol/L EDTA，1% SDS），用塑料研磨棒磨成匀浆后，加入等体积苯酚 ∶氯仿（1 ∶1）混合液抽提，取上清加入1 mL Trizol抽提RNA。总RNA样品用 2 μL DNAaseI（宝生物大连工程有限公司）37 ℃处理 30 min 后热灭活。用NanoDrop2000分光光度计测量RNA的 D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm值及浓度，电泳检测RNA的质量。RT-PCR所用cDNA的反转录方法参照ReverTra Ace qPCR RT 的试剂盒说明书[东洋纺（上海）生物科技有限公司]。

1.3酵母双杂交cDNA文库的构建

取2 μg RNA为模板，参照Clontech试剂盒的要求，反转录成双链cDNA，LD-PCR扩增双链cDNA，并用CHROMASPINTM TE-400Column纯化，去除小于400 bp的片段。将5 μg cDNA与3 μg pGADT7rec 载体参照YeastmakerTM Yeast Transformation System 2试剂盒的要求转入酵母Y187菌株中。经SD/-Leu平皿筛选获得阳性转化子，再用freezing medium 收集菌体，得到freezing medium 酵母悬浮液，将文库的悬浮液分装在2 mL无菌离心管中，置于-80 ℃冰箱中长期保存。

1.4文库插入片段检测

在上述SD/-Leu平板上随机挑取30个单菌落，再用YPDA液体培养基扩大培养，最后采用改良的酵母菌落PCR方法检测插入片段的大小分布，具体步骤如下：取200 μL酵母培养液，离心收集菌体后加入45 μL sorbitol buffer 及 5 μL Zymolyase （上海索莱宝生物科技有限公司），悬浮菌体后 37 ℃ 处理2 h，然后加入150 μL去离子水稀释，95 ℃处理 20 min，再置于冰上冷却5 min，取1 μL产物作为模板，用引物PGADf、PGADr进行PCR扩增，检测文库插入片段的大小（引物序列分别为PGADf：5′-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3′；PGADr：5′-GTGAACTTGCGGGGTTT TTCAGTATCTACGAT-3′），反应体系为：1×KOD Fx buffer，05 mmol/L dNTP 2.5 μL，正反引物各0.1 μmol/L，KOD Fx enzyme 2 U，去离子水补足总体积至50 μL。扩增条件为：95 ℃ 预变性 5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，68 ℃延伸3 min，扩增35个循环；68 ℃延伸5 min。反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5ONAC023/pGBKT7载体的构建及酵母转化

以水稻种子cDNA为模板，用YONAC023f、YONAC023r引物扩增出ONAC023的759 bp完整编码序列（YONAC023f：5′-CGGAATTCATGGCGATGACACCGCAGCT-3′；YONAC02 3r：5′-CGGGATCCCTAGCCACCATGGTTTCTTT-3′），PCR产物纯化后经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，连接克隆到pGBKT7载体上。将测序验证后的载体质粒按YeastmakerTM Yeast Transformation System 2试剂盒的要求转入到酵母Y2HGold菌株中，经SD/-Trp筛选，采用“1.4”中所述酵母菌落PCR方法验证阳性克隆。

1.6酵母双杂交文库的筛选和互作蛋白基因的测定

参照Clontech公司MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid System的说明书完成文库和诱饵蛋白ONAC023/pGBKT7的交配，酵母杂合子悬浮在10 mL 0.5×YPDA培养基中，取 1 μL 悬浮液稀释后涂在SD/-Leu/-Trp培养基中用于计算筛选效率，其余杂合子酵母菌全部涂在含250 ng/mL Aba的 SD/-Leu/-Trp 培养基上，对于初筛得到的阳性克隆重新转移到含250 ng/mL Aba及40 μg/mL x-α-Gal的 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/ 培养基上进一步筛选，能在 4 d 内长出并显蓝色的单菌落即为互作的阳性克隆。采用“1.4”所述的酵母菌落PCR方法扩增出互作蛋白的基因序列，纯化后用T7引物测序即可得到基因序列。

2结果与分析

2.1来源于水稻种子cDNA文库的构建

采用SDS-Trizol抽提受精5 d的水稻种子总RNA，此法能有效去除淀粉、储藏蛋白等杂质，提高抽提RNA的质量。由D260 nm/D280 nm=1.86、D260 nm/D230 nm=1.91可知，抽提的RNA质量较好，没有产生降解以及多聚糖的污染。图1是总RNA样品的琼脂糖凝胶电泳，可见水稻种子的3条带比较清晰，没有出现扩散、拖尾等降解情况，且28S条带明显比18S条带亮，进一步确定RNA质量适合文库的反转录要求。水稻种子总RNA反转录为单链cDNA，再以单链cDNA为模板合成双链cDNA，再将此cDNA过Chromaspin TE-400Column柱子纯化，除去杂质、小片段cDNA。由图2可知，纯化前cDNA的一些小片段已被有效去除。将纯化后的双链cDNA与载体pGADT7-Rec共转化到酵母感受态细胞中完成体内同源重组。将1 μL转化子分别稀释10、100、1 000倍并涂在 SD/-Leu 平皿上，统计平板培养基上的酵母菌落数量（图 3），结果表明，文库的容量为1.1×106库的容量，转化结果较理想，可以满足下一步酵母双杂筛选的需要。为了检测文库插入片段的大小及重复性，笔者随机挑取30个文库转化子，通过酵母菌落PCR反应检测文库插入片段大小。电泳结果显示，插入片段平均大小约750 bp（图4）。

2.2ONAC023是一个种子特异表达转录因子

通过对水稻140个NAC基因家族成员的公共表达谱数

据进行分析，笔者发现了1个种子特异表达转录因子ONAC023（图5）位于水稻2号染色体上，基因座 LOC_Os02g12310 包含2个外显子、1个内含子，CDS全长 759 bp。NCBI上的conserved domain检索显示，12～143位氨基酸是一个保守的NAM结构域。为了验证ONAC023的种子特异表达模式，笔者分别以愈伤、根、茎、叶、叶鞘、幼穗、受精3 d种子、受精7 d种子、受精15 d种子的cDNA为模板，进行 RT-PCR 扩增检测其时空表达模式。如图6所示，ONAC023仅在种子中表达，其中在受精3 d时表达量最高，在受精15 d的种子中最为微弱，在其他组织中并没有检测到扩增信号。因此笔者认为，ONAC023是一个种子特异表达的NAC类转录因子，这样的表达模式也暗示着ONAC023可能在种子发育的早期行使重要功能。

2.3ONAC023互作蛋白的筛选

为了验证ONAC023是否存在自激活，将构建好的BD-ONAC023与pGADT7空载体转化到Y2HGold菌株中。结果显示，BD-ONAC023与pGADT7成功共转化的菌落并不能在含有Aba（250ng/mL）的QDO培养基上存活，表面ONAC023不存在自激活特性。采用酵母交配（mating）的筛选策略，笔者将表达BD-ONAC023诱饵蛋白的Y2HGold菌株以及包含种子cDNA文库的Y187菌株混合培养24 h，再将酵母杂合子均匀涂布在SD/-Leu/-Trp/Aba（250 ng/mL）平皿上，进行第1轮初筛选，初筛选共得到97个阳性单菌落。为验证初步筛选结果，每个阳性单菌落被挑到更高筛选压的 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/Aba（250 ng/mL）/X-α-Gal平皿上进行筛选，能够在2 d内长出显蓝色的菌落即被认为是与ONAC023互作的阳性克隆，生长速度与蓝色深浅则作为互作强度的判断依据。第2轮高压筛选排除61个假阳性克隆（图7）。为了得到这些互作蛋白的基因序列，笔者采用酵母菌落PCR方法扩增出cDNA片段。扩增带型一致的克隆被认为是同一基因，只挑选其中1个，将PCR产物纯化后进行测序。经Blast序列比对，最终筛选到21个与ONAC023互作的蛋白基因，具体基因ID及功能注释如表1所示。这些互作的蛋白包括储藏蛋白质如谷蛋白、Cupin蛋白，具有分子伴侣功能的异构酶peptidyl-prolyl cis-trans isomersae以及一些与代谢相关的酶类，如烯醇酶Enolase、乙醇脱氢酶等。

3结论与讨论

高质量的RNA是构建cDNA文库的第一步，直接影响文库构建的质量。因发育的种子中含有大量的淀粉及储藏蛋白质，采用常规的Trizol法分离得到的RNA往往含有大量的多糖及蛋白成分，多糖与RNA被乙醇共沉淀后影响RNA的溶解及后续的克隆操作。本研究采用改良的SDS-Trizol法，利用SDS和酚仿混合物多次抽提，去除大量的淀粉、蛋白污染，然后再沿用传统的Trizol法提取得到纯净的RNA，可以用于各种分子克隆操作。作为广泛使用的蛋白-蛋白互作研究方法，酵母双杂交是一项常规性的操作[13-14]。本研究在商业化

试剂盒的基础上，对操作程序进行了优化。对于阳性克隆的基因序列进行测定，商品化试剂盒推荐的是从阳性杂合子菌落中提取质粒，然而因其拷贝数低、酵母破壁困难等因素，从酵母中一般只能得到微量的质粒，无法满足测序所需。因此，要将酵母中提取到的质粒重新转化到大肠杆菌中繁殖，以期得到测序所需的模板量，这一操作流程需要4～5 d，费时费力。本研究重新设计了特异的载体多克隆位点两段的引物序列，利用改良的酵母菌落PCR方法，以阳性克隆的酵母菌落为模板，直接扩增出基因序列，PCR产物纯化后直接用T7引物测序即可，一般在12 h内可以完成全部扩增及纯化流程，大大提高了效率。在酵母菌落PCR操作过程中，发现某些传统的酵母破壁方法如沸水加热破壁、SDS破壁以及单纯的破壁酶都不具备良好的重复性。破壁酶结合加热破壁可以有效破除酵母细胞壁，确保质粒释放到溶液中。本研究还将破壁后的反应液稀释数倍以减少酵母破壁后一些次生代谢物的影响。RT-PCR结果显示，ONAC023在种子中特异表达，且在种子发育的早期表达量要高于后期。通过对水稻早期种子的cDNA酵母双杂交文库进行筛选，本研究寻找到21个可能与ONAC023互作的蛋白，包括储藏蛋白质如谷蛋白、Cupin蛋白，分子伴侣以及一些与代谢相关的酶类，其中1个DNA binding蛋白（LOC_Os05g01050）与ONAC023有强烈互作。LOC_Os05g01050编码1个含有135个氨基酸的蛋白，其中 46～106 位氨基酸是一个保守的DNA binding结构域，可能具有转录因子的特性。已有大量报道显示，转录因子一般都是通过与多个蛋白形成复合物来启动下游基因的转录，如 NF-Y 类转录因子就是与其他2个转录因子以异源三聚体复合物的形态工作[15]。因此，我们推测LOC_Os05g01050可能是ONAC023蛋白复合物的成员。公共表达谱数据库检索发现，LOC_Os05g01050是一个组成型表达的基因，其功能尚无报道。本研究结果为研究ONAC023在种子发育中的功能奠定了坚实的基础，尤其是具有转录因子特性的DNA binding蛋白LOC_Os05g01050将是研究的重点。但考虑到酵母双杂交结果存在假阳性的缺点，仍需要其他独立的蛋白-蛋白互作技术，如免疫共沉淀或GST pull down等来进一步验证这些互作结果。

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