正常淋巴液对内毒素休克小鼠内毒素增敏系统的作用＊

崔 浩 孙自贤 崔 颖 陈伟红 张立民 赵自刚 牛春雨

内毒素休克（Endotoxic Shock，ES）引起的多器官损伤是患者死亡的重要原因之一［1，2］。脂多糖结合蛋白（Lipopolysaccharide-Binding Protein，LBP）和脂多糖受体（Lipopolysaccharide Receptor，CD14）可提高机体多种细胞对细菌内毒素或脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的敏感性，使内毒素的生物活性提高数百倍甚至数千倍，是内毒素激活体内炎性细胞合成和分泌大量细胞因子、引起失控性炎症反应、诱发组织和器官损伤的重要增敏系统［3，4］，在脓毒症的发展进程中起到重要作用［5］。本课题组在前期以静脉输入LPS方法建立大鼠内毒素休克模型时发现，输入来自正常犬的肠淋巴液可有效改善内毒素休克大鼠的血液微循环障碍及淋巴微循环障碍［6］，改善肝、肾器官的血液灌注量［7］，降低重要组织器官的黏附分子水平、髓过氧化物酶活性［8］，降低炎症反应、自由基含量和组织损伤［8，9］；Cheng等［10］的 研 究 也 发 现，正 常 肠 淋 巴 液（Normal Mesenteric Lymph，NML）能降低内毒素导致的肺血管内皮细胞的黏附分子表达和炎症反应。可见，正常肠淋巴液对内毒素休克具有一定的干预作用，这也可能是未来防治内毒素休克的有效药物靶点。但内毒素致敏系统在正常淋巴液干预内毒素休克器官损伤过程中，究竟发挥什么作用尚不清楚。为此，本研究侧重观察正常肠淋巴液对内毒素休克内毒素致敏系统的作用。

1 材料与方法

1.1 引流正常淋巴液

18只SPF级、体质量20g-25g的BALC／c雄性小鼠（中国食品药品检定研究院，许可证号SCXK（京）2009-0017）用于正常淋巴液引流。操作方法：小鼠经1%戊巴比妥钠（50mg／Kg，德国／北京化学试剂公司分装）腹腔注射麻醉后，在腹部正中线偏右作一长2cm纵行切口，打开腹腔，暴露肠系膜根部，在手术显微镜下行肠淋巴管插管，持续引流肠淋巴液60min，引流的淋巴液量为每只小鼠20μl-60μl。然后以1 500rpm离心5min，取上清液置于低温冰箱（-75℃）冷冻备用。实验过程中的动物处置方法符合动物医学伦理学标准。

1.2 复制内毒素休克小鼠模型及正常淋巴液干预

另取18只SPF级、体质量20g-25g的BALC／c雄性小鼠（来源同上）随机均分为假休克组（sham shock，SS组）、内毒素休克模型组（ES组）、正常肠淋巴液干预内毒素休克组（简称肠淋巴液干预组）（NML+ES组）。

小鼠经腹腔注射戊巴比妥钠（50mg／Kg）全身麻醉后，在手术显微镜下行股部手术：钝性分离股动脉，经股动脉注射1%肝素钠（1ml／Kg）全身抗凝，插管，通过三通管连接RM6240BD型生物信号采集系统（成都仪器厂），连续监测整个实验过程中的平均动脉血压（Mean Artery Pressure，MAP）。术后稳定30min，ES组和NML+ES组小鼠腹腔注射LPS（O111：B4，美国Sigma公司）；质量分数0.5%，35mg／Kg），成功复制内毒素休克模型［11］。

在LPS注射60min后，NML+ES组小鼠经股动脉［12，13］输入正常淋巴液，输入量参照本课题组前期研究结果［6-9］确定为小鼠全血量的1／15（全血量为小鼠体重的1／13），大约100μl-150μl，输注完成后加推少量生理盐水，以确保淋巴液全部注入体内。

ES组仅注射等量的生理盐水；SS组小鼠仅实施与其它两组小鼠完全相同的手术，不腹腔注射LPS，不输入正常淋巴液，只在相同时间点输入等量生理盐水。

1.3 标本制备

在腹腔注射LPS后6h麻醉小鼠，迅速摘取各组小鼠的肺、心脏、肝脏，置于无菌EP管中，-75℃冻存（702型低温冰箱，美国热电公司）。实验时取出冻存的肺、肝、心肌组织，分析天平称重后，按1∶9比例，加入4℃生理盐水，在冰浴环境中，应用FJ-200型高速分散匀质机（上海标本模型厂）制备10%组织匀浆，使用Labofuge 400R型高速低温离心机（德国科峻公司）于0℃-4℃、3 000r／min离心10min，取上清用于相关指标检测。

1.4 指标检测

应用小鼠LBP、CD14、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、白介素 6（Interleukin 6，IL-6）ELISA检测试剂盒（美国R＆D公司生产、江苏镇江厚普生物科技有限公司合成），先按试剂盒说明书绘制 LBP、CD14、TNF-α、IL-6标准曲线（曲线方程分别为 y＝0.128x+0.003x2-0.0001874x3，r2＝0.9992；y＝0.061x-0.00004486x2-0.000004574x3，r2＝0.9995；y＝0.016x-0.0004087x2+0.00000006004x3，r2＝0.9977；y＝0.045x-0.00005297x2-0.000003114x3，r2＝0.9993）；再按步骤检测各组小鼠组织匀浆的LBP、CD14、TNF-α、IL-6含量。检测仪器为SpectraMax M3型全自动酶标仪（美国 MD公司），OD值于450nm处获得。组织匀浆的蛋白定量采用Bradford法（试剂盒购自碧云天生物技术研究所）。

1.5 统计学处理

应用SPSS 19.0统计学软件。实验数据以均数±标准差（±s）表示，方差齐性资料多组间比较采用单因素方差分析，两两比较或组内比较均用t检验；方差不齐性资料采用Kruskal Wallis检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠多器官组织匀浆LBP含量比较

ES组肺、肝、心肌匀浆的LBP含量均显著高于SS组（P＜0.05）；NML+ES组肺、心肌匀浆LBP含量较ES组明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），且与SS组无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

表1 各组小鼠多器官组织匀浆LBP含量（ng／g protein）（±s，n均＝6）

表1 各组小鼠多器官组织匀浆LBP含量（ng／g protein）（±s，n均＝6）

注：与SS组比较，1）P＜0.05；与 ES组比较，2）P＜0.05

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2.2 各组小鼠多器官组织匀浆CD14含量比较

ES组肺、肝、心肌匀浆CD14含量明显高于SS组（P＜0.05）；NML+ES组心肌匀浆CD14含量与ES组比较显著降低（P＜0.05），但肝、肺组织匀浆CD14含量与ES组比较无显著下降（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠多器官组织匀浆CD14含量（ng／g protein）（±s，n均＝6）

表2 各组小鼠多器官组织匀浆CD14含量（ng／g protein）（±s，n均＝6）

注：与SS组比较，1）P＜0.05；与 ES组比较，2）P＜0.05

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2.3 各组小鼠多器官组织匀浆TNF-α含量比较

ES组肺、肝、心肌匀浆TNF-α含量显著高于SS组（P＜0.05）；NML+ES组肺、肝、心肌匀浆TNF-α含量均显著低于ES组（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠多器官组织匀浆TNF-α含量（ng／g protein）（±s，n均＝6）

表3 各组小鼠多器官组织匀浆TNF-α含量（ng／g protein）（±s，n均＝6）

注：与SS组比较，1）P＜0.05；与 ES组比较，2）P＜0.05

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2.4 各组小鼠多器官组织匀浆IL-6含量比较

ES组肺、肝、心肌匀浆IL-6含量均显著高于SS组（P＜0.05）；NML+ES组肝、心肌匀浆IL-6含量显著低于ES组（P＜0.05），且与SS组无统计学差异（P＞0.05）。见表4。

表4 各组小鼠多器官组织匀浆IL-6含量（ng／g protein）（±s，n均＝6）

表4 各组小鼠多器官组织匀浆IL-6含量（ng／g protein）（±s，n均＝6）

注：与SS组比较，1）P＜0.05；与 ES组比较，2）P＜0.05

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3 讨 论

引起内毒素休克的原因很多，研究者根据不同致病因素建立了多种内毒素休克模型，如静脉输入LPS或菌液［14，15］模拟肠源性细菌、内毒素移位引起的菌血症、败血症休克；腹腔注射LPS或菌液［11-13，16］，模拟急性腹腔感染引起的内毒素性休克；还有以盲肠结扎穿孔［17，18］模拟肠穿孔引起腹腔感染等均有一定的代表性和临床意义。

本课题组在前期研究中，应用静脉输入LPS导致大鼠内毒素休克模型验证了异种正常肠淋巴液对内毒素休克微循环、血液灌注量、白细胞黏附以及器官损伤具有良好的干预作用。为了进一步扩展正常淋巴液的药理学作用，本文应用腹腔注射LPS的方法复制了小鼠内毒素休克模型，结果显示小鼠MAP在腹腔注射LPS后90min-360min的多个时间点显著低于假休克组，并出现了内毒素性休克的典型血压变化，即先下降，后缓慢回升，继续下降至较低水平，尤其是在340min以后（结果将另文发表），表明该模型是成功的。

已有研究表明，LPS除了直接损伤血管内皮细胞、组织实质细胞外，更重要的是其与LBP结合形成的LPS-LBP复合物与单核巨噬细胞表面的CD14结合后激活免疫细胞引起失控性炎症反应，成为LPS导致组织损伤的关键环节。因此，LBP／CD14系统也被称作内毒素增敏系统［19，20］。为了进一步揭示正常肠淋巴液干预内毒素休克的作用机制，本文进一步观察了正常肠淋巴液对内毒素休克小鼠肺、肝、心肌组织LBP／CD14以及炎症因子TNF-α、IL-6含量的影响。结果显示，小鼠在受到内毒素攻击后，肺、肝、心肌组织的LBP、CD14含量均显著升高，成为LPS导致器官炎症反应的重要环节，致使这些器官组织的炎症因子TNF-α、IL-6高水平表达。说明内毒素休克后器官扩散的炎症反应是LPS及LBP／CD14增加LPS作用的共同结果。当给予小剂量正常小鼠肠淋巴液后，内毒素休克小鼠肺组织和心肌组织的LBP和CD14水平显著降低，肺组织炎症因子TNF-α及心肌组织TNF-α、IL-6水平也同步下降。由此表明，正常淋巴液减轻肺、心肌组织损伤的机制可能与其降低内毒素增敏系统的作用有关。

本实验结果还显示，输入正常淋巴液在降低肝组织炎症因子TNF-α与IL-6水平的同时，并未引起肝组织LBP／CD14水平的下降，这提示正常淋巴液减轻内毒素休克肝损伤的作用可能与内毒素增敏系统无关，其作用可能是通过其它途径实现的，如通过提高肝组织血液灌注量［7］、降低白细胞黏附［8］、降低自由基损伤［9］等，也可能存在其它未明了的机制。

综上所述，在腹腔注射LPS导致内毒素休克引起的器官损伤过程中，内毒素致敏系统LBP／CD14发挥着重要的作用；正常肠淋巴液可降低内毒素休克小鼠肺、心肌组织炎症反应可能通过下调内毒素增敏系统LBP／CD14来实现，表明以正常肠淋巴液作为药物靶点，对于防治内毒素休克引起的器官损伤具有一定的参考价值及指导意义。

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