联合免疫失败过程中乙型肝炎病毒S基因突变的母婴配对研究*

张培珍， 尹玉竹， 邓 妮， 周 瑾， 侯红瑛

对感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的孕妇所分娩的新生儿进行乙肝免疫球蛋白和乙肝疫苗主、被动联合免疫，成功率高达95%以上［1］，但仍有免疫失败的发生。免疫失败除与高病毒载量有关外，也与HBV发生基因突变尤其是 S基因区(包括前S和S区)突变所致的免疫逃逸株(vaccine escape mutant，VEM)有关［2-4］。多项研究发现经联合免疫但发生免疫失败的儿童体内HBV的乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)编码区基因突变率明显高于无免疫人群［5］。VEM是发生在联合免疫前源自于母亲，还是联合免疫后源自于选择压力，文献报道不一［6-7］，且大多数研究未将母亲、新生儿和婴幼儿作对比，存在选择偏倚。因此，本研究选择分娩免疫失败婴儿的孕妇及其联合免疫前的新生儿和已完成了联合免疫的7月龄婴儿，将母亲、新生儿和婴儿分别配对，对比其HBV S基因突变的不同，以探讨免疫失败过程中HBV S基因突变的发生率、发生阶段和突变特征。

材料和方法

1 研究对象

选择2008年6月～2011年3月在广州市中山大学附属第三医院定期产检、住院分娩和随访的血清HBsAg阳性孕妇及其所分娩的婴儿。孕妇入选标准:年龄≥20岁;孕周28～42周;HBsAg阳性;HBV DNA≥1×1010IU/L;无严重肝功能异常;血清甲、丙、丁、戊、庚型肝炎系检查呈阴性;孕期未使用抗病毒药物、免疫调节剂和细胞毒性药物，无长期使用糖皮质激素类药物;丈夫系非HBsAg阳性者;B超排除胎儿畸形。排除标准:未能在出生24 h内及时进行主被动联合免疫接种的新生儿及其母亲。

2 研究方法

孕妇在分娩前24 h内留取静脉血2 mL;新生儿于出生6 h内尽早肌肉注射乙肝免疫球蛋白200 IU，并按0、1、6方案接种重组酵母乙肝疫苗10 μg，分别于出生时联合免疫前以及7月龄时采集婴儿外周静脉血检测 HBV 标志物(HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc)及HBV DNA定量，并各留取2 mL静脉血备用。以新生儿出生时HBsAg和(或)HBV DNA阳性并持续至7月龄作为免疫失败标准［8］，研究期间共观察到15例婴儿发生免疫失败，分娩免疫失败婴儿的孕妇、新生儿和已完成免疫接种的7月龄婴儿分别构成母亲组(15例)、新生儿组(15例)和婴儿组(15例)，对比3组间HBV基因型、S基因(包括前S和S)突变率及突变位点的不同。

3 方法

3.1 病毒DNA扩增及鉴定 采用PCR扩增直接测序法进行HBV前S/S基因检测。因前S/S基因较大，将其分为2个片段分别进行PCR扩增，片段1:含部分前S及部分S区，上、下游引物分别为5′-GGGTCACCATATTCTTGGGAAC-3′和 5′-GGACAAACGGGCAACATACC-3′;片段2:含“a”决定簇及周围部分S区，上、下游引物分别为 5′-GGATGTGTCTGCGGCGTTTTAT-3′和 5′-TGCGTCAGCAAACACTTGGC-3′，2 个片段长度均为800 bp左右。PCR扩增采用ABI 2700扩增仪，扩增条件如下:95℃ 变性5 min，随后45个循环(94℃ 30 s，55.5℃ 30 s，72℃ 50 s);最后于 72℃延伸10 min。采用含0.5 kg/L溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR扩增产物。以DNA标志物M1200-50(北京索莱宝科技有限公司)为DNA片段条带大小及浓度标准品，采用凝胶成像分析系统UVP GDS-8000分析PCR扩增的片段长度。将所得片段送上海英潍捷基公司进行DNA测序。

3.2 基因序列同源性及突变位点分析 从GenBank随机下载中国广东省的HBV基因全序列8条作为参考序列(AY817515.1、DQ448628.1、DQ478896.1、DQ478899.1、DQ478901.1、NC003977.1、Y18858.1和AY217370.1)。采用Chromas软件评估测序结果，DNAMAN软件比对DNA序列，以S基因区的突变位点进行HBV基因分型［9］，并利用距离法构建同源树进行同源性分析，根据既往已发表文献，寻找所得序列中可能与联合免疫失败相关并且在3组间有不同的突变位点。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，定量资料采用t检验及秩和检验;定性资料采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 同源性分析

母亲、新生儿和婴儿3组中除2例新生儿样本因HBV DNA定量过少导致PCR扩增失败外，其余43例均成功测序，对比3组HBV前S/S基因的测序结果，15例母亲与所分娩的新生儿和婴儿体内HBV的基因型及亚型完全相同，其中B基因型12例，C基因型3例。对片段1和片段2分别进行同源树簇集分析，15例母亲与所分娩的新生儿及婴儿体内HBV所测序列均各自形成独立的簇集，簇集内同源性为(99～100)%。

2 突变率

片段1和片段2的突变率3组间比较(Kruskal-Wallis检验)，差异均无统计学意义，见表1。

表1 母亲、新生儿和婴儿体内HBV前S/S基因2个片段突变率的比较Table 1.Comparison of mutation rates of the 2 fragments in HBV pre-S/S gene among mothers，newborns and infants［Median(Q1～Q3)］

3 突变位点

3.1 母亲-新生儿(13对)7例新生儿与母亲体内的HBV存在不同的突变位点(共15个位点)，其中有4例母亲体内HBV发生的某些突变(9个位点)没遗传给新生儿，4例新生儿出现母亲所没有的新发突变(5个位点)，这4例中有2例既没有遗传母亲的突变，又同时出现了新发突变，见表2。

3.2 新生儿-婴儿(13对) 仅3例婴儿出现不同于新生儿的突变位点(共3个位点)，即nt273A→A/G、nt512C→C/T、nt1139C→A，前2个发生在S区，并在a决定簇之外，ntC1139C→A则发生在与X编码框重叠的区域，见表2。

3.3 婴儿-母亲(15对) 有9例婴儿出现不同于母亲的突变位点(共25个位点)，其中5例婴儿与新生儿相同，1例母亲与新生儿相同，2例因新生儿样本扩增失败而无法和新生儿比较，仅1例在母亲、新生儿和免疫后的婴儿中均有不同，见表2。

讨 论

HBV S基因区分为前 S和S区，与HBV基因分型密切相关。前 S区含有HBV免疫调理的作用位点和肝细胞的结合位点，含前S颗粒的疫苗在小鼠中的免疫效果明显优于不含前S颗粒的疫苗;S区编码HBsAg，其第124～147位氨基酸为“a”抗原决定簇，是宿主对HBV进行体液免疫最重要的抗体结合位点。前S区 基因突变可导致免疫逃避［10］及HB-sAg与 HBsAb共存［11］。S区基因突变可使 HBsAg发生氨基酸替代，使抗体的中和作用无法进行，从而形成VEM［2］。研究认为与HBV母婴传播免疫失败有关的VEM主要出现在两个阶段:(1)联合免疫前:主要源于母亲被VEM水平感染和/或体内HBV自发突变形成 VEM，并通过垂直传播给新生儿，Ghosh等［12］在未接种乙肝疫苗的乙肝患者体内发现VEM;(2)联合免疫后:新生儿体内的HBV在联合免疫压力下发生基因突变，形成VEM［2］。要明确VEM的发生阶段必须将母亲、新生儿以及免疫接种后的婴幼儿进行对比，我们对比了未进行联合免疫前的新生儿、母亲以及免疫失败后的7月龄婴儿体内的 HBV，研究S基因突变的发生阶段和突变特征，为今后在相应阶段采取适当的防治措施，减少VEM的出现，进一步降低HBV的母婴传播提供分子生物学依据。

表2 母亲、新生儿和婴儿体内HBV前S/S基因突变位点的比较Table 2.Comparison of mutation sites in HBV pre-S/S gene among mothers，newborns and infants

本研究中15例发生免疫失败的7月龄婴儿和新生儿体内HBV的基因型及亚型与母亲完全相同，3组在HBV前S/S基因突变率相比也无统计学差异，在同源树簇集分析中，每对母亲与所分娩的新生儿及婴儿体内的HBV均形成各自独立的簇集，提示新生儿及婴儿体内的HBV与母亲同源;即新生儿及免疫后婴儿体内的HBV均源于母亲垂直传播，与目前研究相符［13］。

对母亲-新生儿体内HBV前S/S基因突变的配对分析(联合免疫前阶段)，提示2组突变率虽无显著差异(P＞0.05)，但却存在着不同的突变位点，母亲体内HBV发生的某些突变并不遗传给新生儿，与既往研究相似，即HBV的传播具有选择性［14］。同时新生儿也出现一些母亲所没有的新发突变。研究认为野生病毒株面对选择性压力时，部分病毒株会出现一些新发突变以适应当前的环境［7，14］。在本研究中，新生儿体内HBV的新发突变可能就是选择性压力下的一种适应性的反应，并在新生儿宿主环境的压力下逐渐积累形成优势病毒株，适应新生儿体内环境，进而导致HBV母婴传播免疫失败。而既往研究多直接将母亲与免疫失败后婴幼儿体内的HBV病毒株进行比对，未与新生儿比对，忽略了母亲体内HBV垂直传播给新生儿过程中存在选择性压力导致的突变问题，而将此类突变归于联合免疫压力，假阳性率偏高。

目前对HBV前S/S区基因突变与联合免疫的相关性研究差异较大。有研究发现应用乙肝疫苗可使HBV S基因发生突变，导致表面蛋白的改变［15］，产生 VEM，可导致已免疫人群的感染［2］。Hsu等［5］研究也认为，经过联合免疫的儿童体内的HBV基因突变率明显高于未免疫的儿童。而Basuni等［6］对比联合免疫与无联合免疫儿童体内HBV S区“a”决定簇的基因突变位点，并无明显差异，认为这些突变源于自然的变异，而非联合免疫所致。另有学者认为HBV感染可能与宿主免疫功能低下有关，而非基因突变所致［16］。在本研究中，15例完成联合免疫但免疫失败的婴儿与免疫前新生儿体内的HBV对比，仅3例出现不同的突变，突变位点(3个)较少，很难判断是否为联合免疫所致，并且在3个突变中虽2个发生在S区，可影响第41位及第162位氨基酸合成，但位于“a”决定簇之外，因此与免疫逃逸应无直接相关性。nt1166dupC发生在与X编码框重叠的区域，有研究认为HBx蛋白可降低胰岛素样生长因子Ⅱ基因P4启动子甲基化水平，进而上调其转录表达［17］，是否影响母婴垂直传播尚不明确。因此，以上突变是否由联合免疫压力造成，还是源于自发突变，以及是否会对免疫失败造成影响均需进一步观察。

本研究也进行了婴儿-母亲之间的配对分析，发现2组的突变率并无差异(P＞0.05)，虽有9例婴儿与母亲体内HBV存在不同的突变位点，除去2例新生儿样本扩增失败的病例，5例婴儿是与新生儿相同的，1例母亲与新生儿相同，仅1例在母亲、新生儿及免疫后婴儿均存在不同的突变位点，同源树分析也提示免疫后婴儿体内的HBV仍源自母亲。与既往研究结果差异较大，考虑主要是因为既往研究多直接将母亲与免疫后不同年龄儿童体内的HBV对比，忽略了随时间推移儿童体内的HBV可自发突变以及水平再感染的可能，而将此类突变都归于联合免疫压力所致，假阳性较高。本研究选择完成全程免疫接种后1个月，即7月龄的婴儿，并和母亲以及免疫前的新生儿作对比，减少了时间的影响和选择偏倚，提高了研究的可靠性。本研究也存在不足，有2例新生儿样本扩增失败，而其母亲和7月龄婴儿均发现多个不同的突变位点，影响了研究结果的准确性。

综上所述，HBV在母亲-新生儿-婴幼儿的传播过程中，新生儿及免疫后婴儿体内的HBV病毒株均源自于母亲;在联合免疫前和免疫后均可发生突变，主要发生在联合免疫前，且以选择压力为主，是否与免疫失败有关尚需进一步研究。

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