尼古丁对人牙龈成纤维细胞的增殖及IL－8表达的影响

孙洪涛，孔凡芝，高津福

(1.江苏大学附属人民医院，江苏镇江 212002;2.天津医科大学总医院，天津 300052)

吸烟是导致牙周病的重要危险因素之一。尼古丁是香烟烟雾中的主要成分，约占烟草生物碱总量的95%以上。有实验表明，尼古丁和烟草浸提液可抑制人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts，HGFs)的生长及贴附;HGFs可通过分泌大量的细胞因子，调节细胞的移动、增殖、分化和产生基质成分，在维持内环境的稳定中发挥作用;细胞因子中的白介素－8(interleukin－8，IL－8)作为一种重要的炎性介质，可直接或通过诱导其他因子参与牙槽骨吸收、胶原酶产生、趋化炎性细胞聚集等一系列可造成组织破坏的炎性反应，从而导致牙周组织破坏，促进牙周病的发展［1］。本实验通过观察不同浓度尼古丁刺激对HGFs增殖、分泌IL－8的影响，探讨尼古丁在牙周炎致病机制中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料

高糖 DMEM培养基(GiBico，美国);胎牛血清、DMSO、MTT、ELISA试剂盒(天津灏洋生物制品科技有限公司);尼古丁(Wako，日本)。

1.2 方法

1.2.1 人牙龈成纤维细胞(HGFs)培养

选择因正畸治疗需拔牙且牙龈健康的志愿者(知情同意)，并于拔牙时切取其少量牙龈组织;按组织块培养法［2］，用含200 mL/L FBS的DMEM培养液，在37℃、50 mL/L CO2、95%湿度条件下培养HGFs。

1.2.2 不同浓度尼古丁对HGFs增殖活性影响的观察

取生长良好的第4代HGFs，制成密度为1×104/mL的单细胞悬液，并以每孔200 μL接种于96孔板，置于37℃，50 mL/L CO2细胞培养箱中进行培养。常规培养24 h待细胞同步化后，吸弃培养液和未贴壁细胞，并将细胞随机分为8组，分别加入含尼古丁浓度为 0 μg/mL(阴性对照组)、10、50、100、250、500、1000、2000 μg/mL 的含 FBS 的高糖DMEM培养基(每孔200 μL)继续培养。

分别于培养第24、48、72 h各时间点取各组细胞(每组5孔)，按MTT试剂盒说明进行相应处理后，用酶联免疫检测仪测各孔530 nm波长的OD值;并按以下公式计算各组细胞的生长抑制率:抑制率(%)=(未加尼古丁组OD值－加入尼古丁组OD值/未加尼古丁组OD值)×100%。

1.2.3 不同浓度尼古丁对HGFs分泌IL－8影响的观察

取生长良好的第4代HGFs，制成密度为1×104/mL的单细胞悬液，并以每孔200 μL接种于96孔板，置于37℃，50 mL/L CO2细胞培养箱中进行培养。常规培养24 h待细胞同步化后，吸弃培养液和未贴壁细胞，并将细胞随机分为8组，分别加入含尼古丁浓度为 0 μg/mL(阴性对照组)、10、50、100、250、500、1000 μg/mL 的含 FBS 的高糖DMEM培养基(每孔200 μL)继续培养。培养72 h后，收集各组细胞培养上清(每组5孔)，按试剂盒说明用酶联免疫吸附测定法检测培养上清中的IL－8含量。首先用酶标仪测各孔540 nm波长的OD值，并以S/S0值(S=标准品或样本的OD值，S0=标准品0点OD值)为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，在对数坐标纸上绘制标准曲线;然后根据样本的吸光度值即可在标准曲线中查得相应IL－8的浓度值(pg/mL)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度尼古丁对HGFs增殖活性的影响

不同浓度(2000、1000、500、250、100、50、10 μg/mL)的尼古丁分别作用于 HGFs 24、48、72 h不同时间后，均能抑制HGFs的生长，各时间点各浓度尼古丁对HGFs生长的抑制率分别与正常对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);而且各浓度尼古丁对HGFs生长的抑制率均随培养时间而逐渐增加，即呈时间依赖性;各时间点内，尼古丁对HGFs生长的抑制率均随其浓度增加而逐渐增加，即呈浓度依赖性(表1)。

表1 不同浓度尼古丁作用HGFs 3 d后的OD值()

表1 不同浓度尼古丁作用HGFs 3 d后的OD值()

浓度(μg/mL) 作用时间(h)24 48 720 0.5510 ±0.0076 0.5334 ±0.0054 0.4244 ±0.005410 0.5270 ±0.0087 0.4830 ±0.0089 0.3736 ±0.004550 0.5178 ±0.0086 0.4552 ±0.0115 0.3572 ±0.0077100 0.5022 ±0.0038 0.4368 ±0.0079 0.3382 ±0.0053250 0.4876 ±0.0112 0.4120 ±0.0073 0.3178 ±0.0068500 0.4610 ±0.0080 0.3966 ±0.0111 0.3018 ±0.00891000 0.4316 ±0.0067 0.3514 ±0.0076 0.2352 ±0.00332000 0.4118 ±0.0090 0.3226 ±0.0179 0.2094 ±0.0086

2.2 不同浓度尼古丁对HGFs分泌IL－8的影响

ELISA 检测显示，HGFs 在 500、250、100、50、10 μg/mL尼古丁作用下，其合成IL－8的量均明显高于正常对照组(P＜0.05)，其中100 μg/mL尼古丁组合成IL－8的量最高;1000 μg/mL尼古丁组对HGFs合成IL－8的影响不明显，与对照组相比无统计学差异(P ＞0.05)(表2)。

表2 不同浓度尼古丁对HGFs合成IL－8影响的比较()

表2 不同浓度尼古丁对HGFs合成IL－8影响的比较()

* 与0 μg/mL 相比 P ＜0.05

尼古丁浓度(μg/mL) IL－8含量(pg/mL)052.58 ±3.8410 144.79 ±6.48*50 151.84 ±5.98*100 181.27 ±3.70*250 138.30 ±3.58*500 95.90 ±2.15*1000 58.06 ±3.58

3 讨论

牙周病变时，由于牙龈上皮受损，细胞间隙增宽，外界的细菌、毒素等有害物质可直接作用于牙周结缔组织，影响其生长代谢和向牙根面的附着。牙龈成纤维细胞作为牙龈固有层的主要细胞，不仅具有活跃的自身更新能力，还可在细菌、毒素等有害物质刺激下分泌多种细胞因子及炎性介质。有研究发现，尼古丁作为香烟烟雾中的主要成分，不仅影响结缔组织细胞如成纤维细胞的细胞形态、附着和蛋白质的合成、分泌，还影响成纤维细胞分泌多种细胞因子及炎性介质［3］。故本实验采用尼古丁作为刺激源刺激体外培养的人牙龈成纤维细胞，观察其增殖及IL－8表达的变化，以期探讨吸烟对牙周病发生发展影响的作用机制。

本实验结果显示，在没有尼古丁作用的情况下，HGFs表达IL－8的量较少;而在一定浓度范围(10 ～500 μg/mL)尼古丁刺激下，HGFs分泌 IL－8的量明显增多，其中以100 μg/mL时最高，此后逐渐降低。当尼古丁浓度达到1000 μg/mL时，对HGFs合成IL－8的影响不明显(与对照组相比无统计学差异)。IL－8作为人体内的一种细胞因子具有广泛的生物学作用，可通过聚集和激活中性粒细胞而促进牙周组织破坏。另外，IL－8作为一种重要的炎性细胞因子，不仅能促进牙槽骨的吸收，同时还能抑制牙周膜的修复和代谢功能，并促进其他炎症介质的释放，从而影响牙周组织的改建、加重局部牙周组织的炎症反应，导致牙周病的发生、发展［4］。据相关文献报道，尼古丁可促进口腔表皮样癌细胞株分泌 IL－8［5］;IL－1、TNF 均能刺激牙龈成纤维细胞产生IL－8，IL－8除能激活人外周血中性粒细胞外，还可与IL－1、TNF及其他炎症介质协同发挥作用，从而介导中性粒细胞在炎症部位的聚集［6］。Iho等［7］发现，尼古丁作用于中性粒细胞后，可使其IL－8表达量增加，且在一定浓度范围内呈时间和浓度依赖性。Giannopoulou等［8］利用实验性牙龈炎模型进行研究发现，吸烟者与非吸烟者相比，其龈沟液中的IL－8表达量明显增加。Wendell等［9］发现，尼古丁可促进人牙龈成纤维细胞分泌 IL－8。Bendre 等［10］报道，在牙周组织局部，IL－8除具有趋化中性粒细胞的作用外，还可间接刺激成骨细胞产生破骨细胞因子(RANKL)并刺激破骨细胞前体细胞的分化。本实验进一步证实，10～500 μg/mL浓度范围内的尼古丁可促进牙龈成纤维细胞分泌IL－8，与上述结果基本一致;提示，尼古丁可通过刺激牙龈成纤维细胞导致炎性细胞因子的分泌，从而发挥免疫调节作用。但本实验中当尼古丁浓度为1000 μg/mL时，对HGFs合成IL－8的影响不明显，可能与尼古丁对细胞的毒性有关。因为在尼古丁浓度过高的情况下，人牙龈成纤维细胞膜被破坏，使细胞蛋白成分减少，并影响细胞微管和波形蛋白细胞骨架，从而影响细胞分泌IL－8。

综上所述，一定浓度范围的尼古丁对体外人牙龈成纤维细胞的增殖及其分泌IL－8能力均有明显的影响，但其作用机制还需进一步研究。

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