低氧预处理及AMPK过表达对过氧化氢抑制牙髓细胞增殖影响的研究

张 萍，李 诚，余 波

(1.安康市中心医院口腔科，陕西安康 725000;2.神木县医院口腔科，陕西榆林 719300)

人牙髓细胞是一种从牙髓组织中分离得到的细胞群，具有繁殖分裂和多分化的潜能，能分化为成牙质样细胞并形成牙本质/牙髓样的结构［1－2］。由于牙髓组织被坚硬的牙体组织所包裹，氧气只能通过狭窄根管中的脉管系统才能到达牙髓细胞［3］。因此，牙髓组织中的氧含量比外围组织更少，更容易因病理变化而导致低氧。同时牙齿所处的环境也使牙髓容易受到外界因素如细菌感染、过氧化物损伤等的影响［4］。

腺苷单磷酸激活蛋白激酶［Adenosine 5’－monophosphate(AMP)－ activated protein kinase，AMPK］是一种参与细胞能量调节的应激蛋白酶［5］。AMPK在结构上是一种由催化亚基(α1和α2)、调节亚基(β1 和 β2)以及 γ 亚基(γ1，γ2 和γ3)组成的异源三聚体蛋白［6］。AMPK可由细胞中增高的AMP/ATP水平所激活，并通过上游激酶的催化将其催化亚基的Thr172位点磷酸化。磷酸化后的AMPK即被激活，并可通过调节细胞中的能量水平而使细胞适应低氧、低糖等周围环境的胁迫［7］。已有研究证明，AMPK参与调控细胞在氧化环境中的生长能力［8］。本实验通过体外培养人牙髓细胞，观察低氧预处理后细胞中AMPK基因的表达及其在细胞抵抗氧化环境中的作用，以期为进一步研究牙髓细胞氧化应激机制提供参考。

1 材料和方法

1.1 主要材料、试剂和仪器

MEM培养基、胎牛血清、胰酶、脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen公司，美国);噻唑蓝(北京精华耀邦医药);Trizol试剂盒、质粒提取试剂盒、DyNAmo SYBR Green qPCR试剂盒、细胞培养板(大连宝生物);Sanyo MCO－15AC细胞培养箱(Sanyo公司，日本)，VIIA 7实时定量 PCR仪(Applied Biosystems公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

取19～29岁志愿者(知情同意)因阻生而拔除的健康第三磨牙，用PBS冲洗干净后，于超净工作台上劈开，小心取出牙髓组织并用眼科剪剪碎，加入3 g/L I型胶原酶37℃下消化30～60 min。然后将消化后的组织块平铺于培养瓶底，加入适量含200 mL/L胎牛血清的MEM培养基，瓶底向上置于37℃、50 mL/L CO2培养箱中进行培养;待组织块贴壁后翻转培养瓶继续培养，每隔3 d换液1次。待细胞生长达80%融合时用2.5 g/L胰酶消化，按1∶2比例传代。取第3代牙髓细胞用于以下实验。

1.2.2 观察低氧预处理对人牙髓细胞AMPK基因表达的影响

取第3代人牙髓细胞，以1×104/孔的密度接种于24孔板，并将细胞随机分为常氧组和低氧组。常氧组细胞置于37℃培养箱中，在常氧(950 mL/L空气，50 mL/L CO2)条件下培养;低氧组细胞置于37℃培养箱中，在低氧(10 mL/L O2，940 mL/L N2，50 mL/L CO2)条件下培养。培养12 h后取各组细胞，用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，并反转录成cDNA。根据Genbank中AMPK基因序列设计并合成引物(上海生工合成)，引物序列为:上游:5’－GGGTGAAGATCGGACACTACGT－3;下游:5'－ TTGATGTTCAATCTTCACTTTG －3';然后以cDNA为模板，以β－actin为内参(其上游引物:5’－CTCCATCCTGGCCTCGCTGT－3’;下游引物:5’－GCTGTCACCTTCACCGTTCC－3’)用qRT－PCR仪检测各组细胞中AMPK mRNA的表达水平。反应体系共25 μL，分别为 DyNAmo SYBR Green qPCR mix 12.5 μL，上 下 游 引 物 各 0.5 μL;cDNA 模 板(＜10 ng/μL)2 μL;无 RNA 酶水 9.5 μL。反应条件为:UNG酶50℃孵育2 min，94℃预变性10 min;94℃ DNA变性20 sec，引物在50℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，共36个循环;72℃后延伸10 min。熔解曲线的制作条件为65～95℃，每0.2℃停留1 sec。基因表达的定量分析采用相对标准曲线法:将克隆的DNA片段按10～104倍比稀释后，由Opticon Monitor 2软件产生最佳荧光基线和标准曲线;目的基因和β－actin基因的拷贝数分别根据产生的Ct值从各自的标准曲线中获得。然后以目的基因的拷贝数除以 β－actin的拷贝数的比值作为靶基因的表达量。实验重复3次，取均值。

1.2.3 观察低氧预处理对H2O2抑制牙髓细胞增殖的影响

取第3代人牙髓细胞，以1×104/孔的密度接种于24孔板，并将细胞随机分为4组，即常氧组、低氧组、常氧 +H2O2组、低氧 +H2O2组;然后按1.2.2的方法分别在常氧和低氧条件下进行培养，其中常氧+H2O2组和低氧+H2O2组细胞于相应条件下培养12 h后，分别于各孔中加入10 μL 0.1 mmol/L H2O2液处理4 h;然后各组细胞均更换常规培养液，并在正常条件下(37℃，950 mL/L空气，50 mL/L CO2)继续培养。分别于培养24、48、72、96 h各时间点取各组细胞，每孔加入 20 μL MTT(5 mg/mL)继续培养4 h;然后吸去上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，震荡混匀后用酶标仪测量各孔490 nm波长的吸光度值(OD值)。

1.2.4 观察AMPK基因过表达或沉默后牙髓细胞表达AMPK的变化

1.2.4.1 AMPK过表达重组质粒的构建和鉴定

利用Trizol试剂盒提取人牙髓组织的总RNA，并利用反转录试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，用含有 HindⅢ 和BamHⅠ 酶切位点的引物(上游引物:5＇－ CAAGCTTGCATAGATTAGCAGCATTGAAAGC－3＇;下游引物:5＇－ CGGATCCGAATACACCCACCAGAATAGCACA －3＇)对AMPK基因进行扩增;然后将扩增产物克隆到p3XFlag－CMV中构建AMPK过表达重组质粒。取1 μL重组质粒转染大肠杆菌，并将其置于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜;次日4000 r/min离心10 min收集菌体，用质粒提取试剂盒提取质粒后以HindⅢ 和BamH I进行双酶切;酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳，对重组质粒进行鉴定。

1.2.4.2 AMPK siRNA 的合成

根据Genbank中AMPK基因序列设计并合成siRNA，其具体序列为 5’ －GATCCGGTTGTATGCTGGTCC－3’(上海捷瑞合成)。

1.2.4.3 细胞转染和 AMPK mRNA 检测

将第3代人牙髓细胞接种于24孔板，常规培养至细胞生长达80%融合时，弃原培养液，并将细胞随机分为正常对照组、AMPK过表达组、AMPK沉默(RNA干扰)组。其中正常对照组加入常规MEM(500 μL/孔)继续培养;过表达组加入含50 μL AMPK过表达重组质粒(重组质粒－LipofectamineTM2000复合物，质粒浓度 4 μg/mL)的MEM(500 μL/孔)进行转染;沉默组加入含 50 μL siRNA(SiRNA－LipofectamineTM2000复合物，siRNA浓度120 Pmol/L的 MEM(500 μL/孔)进行转染。转染6 h后，用qRT－PCR仪按1.2.2相同的方法分别检测各组细胞中AMPK mRNA的表达水平。

1.2.5 观察AMPK过表达对H2O2移植牙髓细胞增殖的影响

取第3代人牙髓细胞接种于24孔板，并将细胞随机分为4组，即:正常对照组、正常细胞 +H2O2处理组、AMPK过表达+H2O2处理组、AMPK沉默+H2O2处理组。其中正常对照组用常规MEM在正常条件下进行培养;H2O2处理组细胞加入 10 μL 0.1 mmol/L H2O2处理 4 h 后，然后换用常规MEM继续培养;AMPK过表达+H2O2处理组和AMPK沉默+H2O2处理组先按1.2.4.3的方法分别转染AMPK过表达质粒或AMPK siRNA后，再加入10 μL 0.1 mmol/L H2O2处理 4 h，然后换用常规MEM继续培养。分别于培养后24、48、72、96 h各时间点取各组细胞，用MTT法检测细胞的增殖情况，具体方法同 1.2.3。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 低氧预处理对牙髓细胞中AMPK基因表达的影响

为观察低氧环境对细胞AMPK基因表达的影响，将牙髓细胞分别在常氧和低氧环境下进行培养。12 h后RT－PCR检测结果显示，低氧组牙髓细胞中AMPK mRNA的表达水平显著高于常氧组(P＜0.05)(图1)。表明低氧环境能够上调牙髓细胞中AMPK基因的表达。

图1 低氧和常氧环境下牙髓细胞AMPK mRNA表达水平的比较(* 与常氧组相比P＜0.05)

2.2 低氧预处理对H2O2抑制牙髓细胞增殖的影响

将牙髓细胞分别置于常氧、低氧环境下培养12 h后，再用0.1 mmol/L H2O2处理细胞4 h;然后在常规条件下进行培养，并分别于培养24、48、72、96 h各时间点用MTT法检测各组细胞增殖情况。结果显示:不用H2O2处理时，常氧和低氧预处理的两组细胞的增殖能力基本一致(P＞0.05)，均随培养时间而逐渐增加;用H2O2处理后的常氧组和低氧组细胞的增殖能力均较其对照组显著降低(P＜0.05);其中常氧+H2O2组细胞的增殖能力最低，与低氧+H2O2组相比，各时间点的差异均有统计学意义(P＜0.05)(图2)。提示，低氧预处理能减轻氧化环境对牙髓细胞生长的抑制。

图2 各组牙髓细胞增殖能力比较

2.3 AMPK基因过表达或沉默后牙髓细胞表达AMPK mRNA的变化

分别将AMPK基因过表达质粒或siRNA转染牙髓细胞6 h后，RT－PCR检测结果显示:与对照组相比，转染过表达质粒的细胞中AMPK mRNA表达显著升高(P＜0.05)，而转染siRNA的细胞中AMPK mRNA的表达明显受到抑制(P＜0.05)(图3)。

图3 AMPK基因过表达和沉默后牙髓细胞表达AMPK的变化(* 与对照组相比P＜0.05)

2.4 AMPK基因过表达对H2O2抑制牙髓细胞增殖的影响

为观察AMPK基因在牙髓细胞抵抗氧化环境中的作用，以0.1 mmol/L H2O2分别对正常牙髓细胞以及转染AMPK过表达质粒或siRNA的牙髓细胞处理4 h;然后换用常规MEM继续培养，并用MTT法分别检测各组细胞在培养24、48、72、96 h的增殖情况。结果显示:与正常对照组相比，经H2O2处理的各组细胞在培养48 h后各时间点的增殖能力均明显降低(P＜0.05);但AMPK基因过表达组受H2O2的影响最小，培养48 h后各时间点的细胞增殖能力均明显高于正常细胞+H2O2组(P＜0.05);而 AMPK基因沉默(siRNA)组受H2O2的影响最明显，培养24～96 h各时间点的细胞增殖能力均明显低于其他各组(P＜0.05)(图4)。以上结果表明，AMPK基因过表达有助于牙髓细胞抵抗氧化环境，可减轻氧化环境对细胞增殖的抑制作用。

图4 AMPK过表达对H2O2抑制牙髓细胞增殖的影响

3 讨论

牙髓细胞是指牙髓组织中的一种处于未(低)分化状态，且可塑性强，并保持有分裂、增殖和分化能力的细胞群［9］。牙髓细胞对于牙本质的形成和损伤修复均具有重要作用，但由于其在口腔环境容易受各种外界因素的影响而导致损伤，因此研究牙髓细胞抵御环境损伤的相关机制具有重要意义。

近年来关于不同细胞在低氧环境中的反应，已有较多研究报道。Dippolito等［10］发现，人骨髓细胞在30 mL/L O2环境中培养时，其分裂活性增高，并且维持不分化的状态。Packer等［11］报道，人成纤维细胞在20 mL/L的O2环境下进行培养时，不仅可使其分裂活性增高，同时还能延长其生命周期。此外，关于低氧环境对大鼠、猪、犬、人等不同来源牙髓细胞的影响也有较多研究［12－13］。Wang等［14］报道，通过低氧环境培养能增强牙髓细胞的分裂活性，并使其STRO－1阳性细胞的比例增高。Iida等［13］发现与常氧条件相比，低氧环境培养不仅能使人牙髓细胞的增殖能力明显增高，并且可使源于老年患者的牙髓细胞恢复分裂和分化的能力。AMPK是一种应激调节蛋白酶，多种细胞环境如低氧、H2O2、缺糖、炎症细胞因子刺激等均能影响其在牙髓细胞中的表达。Fkuyama等［15］发现，RPCC2A牙髓细胞在低氧浓度(20 mL/L)条件下培养24 h后，细胞增殖率与正常氧浓度组(200 mL/L)相比无明显区别，但低氧条件可上调牙髓细胞中AMPK蛋白的表达;同时，将细胞中的AMPK基因沉默72 h后，无论在低氧条件下还是在常氧条件下进行培养，细胞的增殖均明显下降。Zhou等在研究牙髓细胞的自噬现象时发现，AMPK/mTOR信号通路可介导细胞在低氧应激中的自我吞噬;同时还发现，若利用复合体C抑制AMPK活性，则能导致牙髓细胞的凋亡［16］。本结果显示，低氧预处理不仅能上调人牙髓细胞中AMPK基因的表达，同时还能增强细胞在氧化环境中的增殖能力，从而减轻H2O2对细胞增殖的抑制作用。

超氧负离子、H2O2、游离羟基以及氧负离子等均为细胞内活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的主要成分，并且能在细胞中互相转化。在上述这些分子中，H2O2最为稳定，也是细胞中ROS的主要存在形式。H2O2作为一种强氧化剂，能在牙齿漂白过程中形成自由基，并能穿过釉质和牙本质进入髓室中。有研究发现，牙齿漂白后其髓室中的 H2O2含量可达到 450 mmol/L［17］。目前已证实，H2O2能够诱导牙髓组织坏死和细胞凋亡。Wu TT等发现，H2O2处理可导致人牙髓细胞的增殖能力降低，并可诱导细胞中caspase 3和caspase 9基因的表达水平显著上升［18］。另有研究发现，AMPK的激活能够抑制H2O2诱导的细胞死亡。Hwang JT等［19］在H9c2肌肉细胞中加入H2O2进行培养时发现，利用白藜芦醇激活细胞中的AMPK活性能使细胞获得对H2O2诱导凋亡的抗性。本结果也发现，AMPK基因过表达能增强牙髓细胞在氧化环境中的增殖能力，并减轻H2O2对细胞增殖的抑制作用;而通过RNA干扰使AMPK基因沉默后，则可导致细胞的增殖能力显著下降。

综合上述，低氧处理可上调牙髓细胞中AMPK mRNA的表达水平，并能减轻因H2O2对细胞增殖的抑制作用;通过AMPK基因过表达可使牙髓细胞获得对H2O2氧化的抗性，亦能减轻H2O2对细胞增殖的抑制作用。然而，关于AMPK在牙髓细胞氧化应激中的具体作用机制尚需进一步研究。

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