珍珠母炮制前后寡肽类化合物的结构鉴定及对比分析△

张辉，刘东，李影，赵好冬，李梅，孙佳明

(长春中医药大学 中医药与生物工程研发中心，吉林 长春 130117)

研究开发

国家自然基金——基于肽链热振荡理论对热炮制珍珠母物质基础与生物活性变化机理研究(81073048)

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孙佳明，副研究员，硕士生导师，研究方向：中药药效物质基础；E-mail:sun_jiaming2000@163.com

珍珠母炮制前后寡肽类化合物的结构鉴定及对比分析△

张辉，刘东，李影，赵好冬，李梅，孙佳明*

(长春中医药大学 中医药与生物工程研发中心，吉林 长春 130117)

目的对中药珍珠母炮制前后寡肽类化合物结构进行鉴定及对比分析。方法采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-DAD-ESI-MS/MS)技术对珍珠母炮制前后的寡肽类化合物进行结构分析。结果初步解析了珍珠母生品中4个寡肽化合物的结构，分别为Op-1(COOH-Lys-Ala-NH2)、Op-2(COOH-Asn-Val-NH2)、Op-3(COOH-Asn-Val-Ala-NH2)和Op-4(COOH-Asn-Val-Ala-Ala-NH2)；而炮制品中不含Op-1，含有其他3个寡肽Op-2、Op-3和Op-4。结论本方法可用于珍珠母药材中寡肽类化学成分的快速分析及结构鉴定，并对珍珠母炮制前后的药效物质变化规律及炮制机理研究提供了科学依据。

珍珠母；寡肽；炮制；高效液相色谱；电喷雾质谱

珍珠母为蚌科动物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)、褶纹冠蚌Cristariaplicata(Leach)或珍珠贝科动物马氏珍珠贝Pteriamartensii(Dunker)的贝壳，为我国传统中药,收载于历版《中国药典》，具有平肝潜阳，安神定惊，明目退翳的作用，用于头痛眩晕，惊悸失眠，目赤翳障，视物昏花[1]。其主产于江苏、浙江、河北、安徽等地，多数集中在江苏苏州，加工制成纽扣，剩余残料销往全国各地，作珍珠母入药。近年来，国内外学者对珍珠母中的化学成分进行了大量研究，表明珍珠母中含有碳酸钙、硬蛋白、氨基酸、微量元素等多种化合物，并发现它们具有抗氧化、利尿、抑制肠管和子宫收缩等作用。目前，关于珍珠母的文献报道主要集中在对珍珠母的氨基酸、微量元素等含量测定[2-4]和抗氧化活性研究[5]上，而应用液相色谱-质谱联用技术对珍珠母中寡肽类化合物的结构鉴定，尤其是对珍珠母炮制前后寡肽类化合物的对比分析尚未见报道。近年来，高效液相色谱-质谱联用技术在中药的快速分析分离及结构鉴定方面显示出越来越重要的作用[6-7]。本文对珍珠母及其炮制品中寡肽类化合物一级结构进行了对比分析研究。

1 材料与仪器

1.1 材料

珍珠母采于吉林省嫩江畔月亮湖，经长春中医药大学张辉教授鉴定为蚌科动物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)的贝壳。

1.2 仪器

BS110S电子天平(德国赛多利斯股份公司)；FD-1000冻干机(东京理化株式会社)；电热恒温水浴锅(北京国华医疗器械厂)；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；CR20B2 型冷冻高速离心机(日本日立)；闪式蒸发浓缩系统(长春康彼达科技有限公司)；Agilent 1100HPLC，Agilent 6350 ESI-MS/MS(美国Agilent公司)。

2 方法

2.1 样品的制备

珍珠母生品：将晾干的珍珠母粉碎过40～60目筛。

珍珠母炮制品：将珍珠母生品于150 ℃烘箱中烘烤1 h，取出，晾凉即得。

珍珠母生品总寡肽：取珍珠母生品1 kg，加蒸馏水3 L，加热回流提取2次，每次2 h，滤过，合并滤液，闪蒸浓缩后，冻干，取珍珠母生品冻干粉粉末5 mg，加水1 mL溶解，过0.45 μm膜，供液质联用分析。

珍珠母炮制品总寡肽：依珍珠母生品总寡肽的制备方法制得。

2.2 色谱条件

Venusil ASB-C18色谱柱(150 A，250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为1‰甲酸乙腈(A)，1‰甲酸水溶液(B)，进样量为10 μL，流速为0.3 mL·min-1，柱温为30 ℃，洗脱时间为20 min，按A-B(1∶99)等度洗脱。

2.3 质谱条件

电离源：电喷雾离子源(ESI)，检测方式：正离子检测，扫描范围：m/z 50～1 200，干燥气温度：350 ℃，干燥气流量：11.0 L·min-1，雾化气压强：45.0 psi，毛细管电压：4 kV。

3 结果

取珍珠母生品和炮制品总寡肽按上述色谱条件和质谱条件应用液质联用仪分析，得到二者的总离子流图及各肽的一级、二级质谱图。对珍珠母生品和炮制品总寡肽总离子流图的色谱峰进行对比分析，发现其生品和炮制品中都有准分子离子为m/z 232、303和374的寡肽类化合物，但炮制品中一个准分子离子为218的二肽消失，以上4个寡肽类化合物依照出峰时间命名为Op-1、Op-2、Op-3和Op-4，二者总离子流图如图1所示。

A.生品 B.炮制品1.Op-1 2.Op-2 3.Op-3 4.Op-4图1 珍珠母生品和炮制品总寡肽的总离子流图

电喷雾质谱是一种软电离技术，在正离子模式下，经常同时出现[M+H]+、[M+Na]+、[2M+H]+、[2M+Na]+等一系列准分子离子峰，但寡肽类成分的准分子离子峰一般为[M+H]+[8]。根据珍珠母生品和炮制品总寡肽准离子峰可以确定各化合物的分子量信息，通过碰撞诱导解离(CID)使目标化合物碎裂成碎片离子，从而可进一步获得各寡肽的一级结构信息。例如生品和炮制品总寡肽中共有的Op-2准分子离子峰[M+H]+m/z为232，说明其分子量为231，氨基酸的平均分子量为128，根据氮律分子应含偶数个氮，推断峰2可能为二肽化合物；在碰撞诱导解离过程中，m/z 232离子失去一分子水(18Da)生成m/z 214离子；m/z 232离子失去一分子缬氨酸(117Da)生成m/z 115离子；m/z 115为天冬酰胺脱去水加氢而生成的离子。结合寡肽类裂解规律，推知Op-2由缬氨酸和天冬酰胺两个氨基酸脱水形成酰胺键后生成的二肽，其一级结构为COOH-Asn-Val-NH2。珍珠母生品和炮制品总寡肽的HPLC-DAD-ESI-MS/MS分析结果见表1。

表1 珍珠母生品和炮制品总寡肽正离子扫描模式的HPLC-DAD-ESI-MS/MS分析结果

注：+表示含有寡肽化合物，—表示不含有寡肽化合物。

4 讨论

通过对珍珠母生品总离子流图的分析，结合寡肽化合物的裂解规律，对珍珠母生品中的寡肽化合物进行分析及结构鉴定，推断出Op-1、Op-2、Op-3和Op-4的一级结构，说明珍珠母中含有寡肽化合物。通过生品与炮制品的总离子流图的对比分析，发现珍珠母经过炮制后仍然含有寡肽化合物，二者都含有分子量为231、302和373的寡肽化合物，而炮制品中一个分子量为217的二肽消失，可能是在炮制时因温度过高而使肽键断裂，二肽消失。从传统炮制经验可知，珍珠母经炮制后易于煎煮并提高疗效，这可能与现代热振荡理论中蛋白、肽类成分中肽键经热振荡发生结构的变化，导致了活性发生相应的改变有关，这为探讨传统中药炮制理论提供了科学的证据。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：216.

[2] 铁步荣,云秦川.中药珍珠母中碳酸钙的含量测定[J].中国海洋药物，1991，(2)：28-30.

[3] 李桂萍.不同品种珍珠母中氨基酸的含量测定[J].北京中医药大学学报，1994，17(1)：60-62.

[4] 李轩贞,成立华.珍珠母中微量元素的研究[J].中国海洋药物，1990，(3)：5-7.

[5] 龙盛京，岑立烨，覃爱娟，等.马氏珍珠母贝提取液抗氧自由基作用的研究[J].中国生化药物杂志，1999，20(1)：41-43.

[6] 刘荣霞，果德安，叶敏，等.液质联用技术(LC/MS)在中药现代研究中的应用[J].世界科学技术—中医药现代化，2005，7(5)：33-40.

[7] Cai ZW，Lee FSC，Wang XR.A capsule review of recent studies on the application of mass spectrometry in the analysis of Chinese medicinal herds[J].Journal of Mass Spectrometry，2002，37：1013-1024.

[8] 王贤纯，陈平，梁宋平.液相色谱-串联质谱分析化学合成多肽及其主要副产物[J].中国生物化学与分子生物学学报，2003，19(5)：576-581.

AnalysisofOligopeptidesinMargaritiferaconchaandProcessedMargaritiferaconchabyHPLC-DAD-ESI-MS/MS

ZHANGHui,LIUDong,LIYing,ZHAOHaodong,LIMei,SUNJiaming*

(DevelopmentCenterofTraditionalChineseMedicineandBioengineering,ChangchunUniversityofTraditionalChineseMedicine,Changchun130117,China)

Objective：Comparison of the structures of oligopeptides inMargaritiferaconchaand processedMargaritiferaconcha.MethodsAnalysis of oligopeptides inMargaritiferaconchaand processedMargaritiferaconchaby HPLC-DAD-ESI-MS/MS.ResultsFour oligopeptides fromMargaritiferaconchawere identified,which are Op-1(COOH-Lys-Ala-NH2)、Op-2(COOH-Asn-Val-NH2)、Op-3(COOH-Asn-Val-Ala-NH2)and Op-4(COOH-Asn-Val-Ala-Ala-NH2)respectively.There were Op-2,Op-3 and Op-4 in processedMargaritiferaconcha.,except Op-1.ConclusionThe method could be used to analyze the structures of oligopeptides inMargaritiferaconchaand processedMargaritiferaconchaquickly.Furthermore,it provides a scientific basis for these active components change rules and the process mechanism ofMargaritiferaconchain preparation process.

Margaritiferaconcha;Oligopeptide;Preparation;HPLC;ESI-MS

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.005

2013-11-23)