PCR技术在城市空气卫生检测中的应用

王丽华，徐振强



PCR技术在城市空气卫生检测中的应用

王丽华，徐振强

100076 北京航天总医院血液肿瘤研究所（王丽华）；100048 北京，中国城市科学研究会（徐振强）

世界卫生组织（WHO）在 1994 年提出了健康城市的定义：“健康城市应该是一个不断开发、发展自然和社会环境，并不断扩大社会资源，使人们在享受生命和充分发挥潜能方面能够互相支持的城市”。国外中大型城市正在通过改善城市空气品质来逐步实现该目标。然而，我国城市空气质量相当严峻，城市离健康标准仍有较大差距，广泛存在以颗粒物 2.5（particulate matter 2.5，PM 2.5）为核心的灰霾污染。生物气溶胶作为 PM 2.5 的重要组成部分，是指悬浮于气态介质中生物来源的颗粒物，包括细菌、真菌、病毒和它们的副产物等，直接影响城市空气卫生质量。生物气溶胶无处不在，通过呼吸暴露会造成诸多负面健康效应，如肺功能障碍、哮喘、传染性和过敏性疾病等。与此同时，伴随城镇化的稳步推进、城市人口的高密度集聚和生产生活方式的改变，城市空气卫生污染作为 PM 2.5 危害的核心组成部分，对人群健康构成的潜在暴露风险日益凸显。空气生物卫生质量的检测是表征其暴露风险的关键步骤。本文系统介绍了国内外在空气微生物离线检测的若干经典和先进技术手段，并结合当前空气卫生监管的需要进行评价，为国内相关卫生机构提升检测水平提供参考。

1 聚合酶链式反应法在空气生物卫生检测中的应用

聚合酶链式反应（PCR）法又称无细胞分子克隆系统或基因扩增技术，出现于 1988 年，是微生物学研究领域的重大创新[1]。PCR 仅需要极少量的目标 DNA 就可以针对性地扩增上百万次，检测限显著降低，可以对微量的生物气溶胶进行检测，并且 PCR 扩增针对的是所有的生物气溶胶，不仅包含可培养部分还包括不可培养的部分。从理论上讲，PCR 可以检测单分子 DNA 或者一个目标 DNA 分子。在分子生物学技术中，随着 PCR、qPCR 和 RT-PCR 等技术的发展，近年也越来越多地应用于空气样品中生物细胞的分析研究[2]。这些技术可以用聚合酶将环境样品中提取的少量 DNA 或 RNA 片段扩增，并且其初始浓度可以用 DNA 标准样品和它们荧光水平的循环阈值——Ct 值来测定。PCR 技术不仅可以显著降低空气样品中生物气溶胶的检出限，还可以极大缩短获得充足的空气样品所需的采样时间。研究表明，qPCR 的检出限为 50 ~ 100 bp/ml[3]。针对空气中的微生物残体和动物过敏原，由于缺乏完整的生命结构，因此无法用 qPCR 进行检测，但是，检出以上物质对于传染源的监测十分重要。此外，DNA 样品准备过程中可能的污染是这些技术应用的另一个重要问题。尽管如此，与传统培养技术相比，使用基于 PCR 的技术可显著降低生物气溶胶的检测限并缩短采样时间。因此，近年来PCR 技术被广泛用于生物气溶胶，特别是病毒的检测研究。关于聚合酶链式反应在生物气溶胶科学中的应用如表 1 所示。随着微纳米加工工艺水平的发展，出现了将传统的 PCR 系统缩小体积与采样系统集成到芯片实现微型化的技术，应用该技术能够检出猪圈空气中的流感病毒[4]。

PCR 在生物气溶胶检测的研究中，引物的选择至关重要[13]。以室内生物气溶胶为例，有文献报道，选择了 53 种引物来研究它们的扩增效果，最终分别筛选出了 3 对和12 对细菌气溶胶和真菌气溶胶的通用引物。表 2 列出了在生物气溶胶研究中经常用到的引物。

表 1 聚合酶链式反应在生物气溶胶科学中的应用

表 2 生物气溶胶研究中常用的聚合酶链式反应引物

除了以上总结的技术方法外，其他与 PCR 联用的手段，如变形梯度凝胶电泳（DGGE）和末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）也越来越多地应用于微生物气溶胶多态性的分析中[20-21]。DGGE 是一个通过化学试剂梯度分离 DNA 片段的电泳过程。Haukka[22]于 1999 年就曾指出，DGGE 方法可用于空气中生物气溶胶的研究。然而，直到 2007 年，PCR-DGGE 技术才真正在生物气溶胶领域开始得到应用[23]。随后，该技术在生物采样器对比[6]、生物气溶胶外场观测[24]、生物气溶胶的灭活等方面得到广泛应用，并且越来越多地应用于描述使用不同采样工具采集、从不同地理位置获得以及用不同方法灭活的生物气溶胶样品之间的微生物多样性的差异。表 3 总结了近年来 PCR-DGGE 技术的应用情况。T-RFLP 技术融合了 PCR、RFLP 技术和 DNA 测序技术，是一种全新、快速、有效的微生物群落结构分析方法，可以描述微生物群落。这一方法也应用于研究空气中的微生物结构[20]。

表 3 PCR-DGGE 在生物气溶胶领域的应用

2 基于 PCR 法检测空气微生物的优势分析

近年来，PCR、qPCR 和 RT-PCR 技术越来越多地用于生物气溶胶的分析[3-9]。使用这些技术不仅显著降低了生物气溶胶的空气样本检测限，还可以降低采样时间，减少空气样本体积。qPCR 检测限是 50 ~ 100 拷贝/μl。研究表明，qPCR 能够检测出细菌气溶胶浓度差异在 1.3 ~3.2 倍之间的样品[26]。除了细菌和病毒的鉴定外，PCR 技术还被广泛应用于空气样本中真菌孢子的分析[27]。

3 结语

将 PCR 技术和生物气胶的采集技术联用在近年的文献中得到较为全面的论述[6]。当然，这些微生物研究手段也有其自身的局限性，如 DNA 的提取、环境变量矩阵、冗长的检测时间和较大的实验劳动负荷等[2]。此外，微生物和动物的过敏原无法使用定量 PCR 分析，并且该技术没有提供关于生物气溶胶活性方面的信息，而这方面的信息对于传染源的识别是非常重要的。此外，在 DNA 样品制备中造成的人为污染也是一个重要的技术问题。尽管如此，PCR 技术与传统的培养方法相比，大大降低了检测限，是生物气溶胶检测领域的里程碑。培养、显微镜观察和 PCR 是微生物鉴定检测的金标方法，其中 PCR 方法由于基于基因尺度，具有较高的特异性和超低的检测限，是空气卫生检测的核心方法。在生物气溶胶的 PCR 方法检测过程中，需要进一步做如下优化：

⑴鉴于生物气溶胶样品在采样过程中不可避免引入的杂质干扰和浓度水平较低的特性，需要对生物气溶胶样品进行必要的前处理，并在 PCR 实验中进行条件优化[2, 4, 12]；

⑵DGGE 作为微生物多态性研究的技术手段，能够直观地反映不同环境中生物气溶胶的暴露特征[13]，将其引入到对生物气溶胶的种类的多态性研究中，可直观地用于分析环境生物气溶胶的暴露风险，特别是与分粒径的采样装置联用，开展分粒径差异的人群吸入风险研究，尤其是针对PM 2.5 和 PM 1.1 以下空气动力学直径的粒子；

⑶当前的 PCR 卫生检测，主要是针对单种或若干种致病性微生物的检测，近年来出现了基于通用引物的扩增检测分析，但得到的结果中存在非致病性微生物，因此存在高估空气暴露卫生风险的可能，并且缺少与直接致病相关的暴露特征，因此，需建立空气微生物种群谱图研究，进一步通过基因测序和生物信息学手段，设计一系列与健康相关的 PCR 引物，结合微型点阵 PCR 技术，实现在芯片上的快速检测分析。

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徐振强，Email：xuzhenqiang@chinasus.org

2013-12-14

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.011