微小RNA—21在乳腺癌细胞中的作用

李振宇+冯云+卢秀波

【摘要】 目的：探讨微小RNA（miR）-21在乳腺癌细胞（MCF7）中的作用。方法：对MCF7细胞转染miR-21，采用免疫组织化学法检测转染后程序性细胞凋亡4（PDCD4）表达；用噻唑蓝（MTT）比色法测转染miR-21后MCF7细胞增殖；流式细胞术检测转染后MCF7细胞凋亡。结果：经免疫组织化学检测，转染组未见染色，对照组细胞胞质呈棕褐色，转染组PDCD4的表达明显低于对照组，MTT法检测转染组细胞活力增加（P<0.05）。转染组的凋亡率为（3.14±0.24）%，明显低于空白组、空质粒组的（8.04±0.02）%、（9.41±0.53）%，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：PDCD4是miR-21的靶基因之一，miR-21的高表达可促进乳腺癌的发展。

【关键词】 乳腺癌； 微小RNA-21； 程序性细胞死亡因子4

The Role of MicroRNA-21 in Human Breast Cancer Cells/LI Zhen-yu，FENG Yun，LU Xiu-bo.//Medical Innovation of China，2014，11（28）：004-006

【Abstract】 Objective：To investigate the role of microRNA（miR）-21 in the human breast cancercells（MCF7）.Method：The MCF7 transfection of miR-21 was transited，programmed cell death 4（PDCD4） expression after transfection was detected by immunohistochemical，transfected with miR-21 MCF7 cell proliferation measured by tetrazolium（MTT） assay；transfected MCF7 cells withered die was detected by flow cytometry.Result：The control group was detected by immunohistochemistry，cytoplasmic brown color，the transfection group showed no staining，transfected group programmed cell death 4（PDCD4） expression was significantly lower than the control group，MTT assay transfected cell viability was significantly be promoted（P<0.05）.Transfection group apoptosis rate was（3.14±0.24）%，it was significantly lower than （8.04±0.02）%，（9.41±0.53）% in a blank group and empty plasmid group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：PDCD4 is a miR-21 target genes of high expression of miR-21 can promote the development of human breast cancer.

【Key words】 Breast cancer； miRNA-21； PDCD4

First-authors address：Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Luoyang 471009，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.28.002

微小RNA（miRNAs）是一种在真核生物中发现的内生性RNAs，长度大约为21～25个核苷酸，广泛存在于哺乳动物基因组中，具有高度的保守性[1]。现已明确，miRNA在肿瘤的发生发展中起着关键的调控作用。笔者通过瞬时转染miR-21于人乳腺癌细胞系MCF7中，检测转染前后细胞的增殖、凋亡及PDCD4的表达，探讨两者的关系及在乳腺癌中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌细胞系MCF7购自南京科诺生物有限公司、Hyclone胎牛血清、DMEM培养液购自TM公司（宝信生物科技有限公司分装）、真核质粒pEZX-eGFP-miR-21（广州复能基因有限公司）、质粒抽提试剂盒及无内毒素质粒提取试剂盒（北京康为公司）、胶回收试剂盒（TaKaRa公司）、兔PDCD4IgG（Abcam公司）、抗兔抗体（Santa Cruz公司）、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，实验室配制）、噻唑蓝（MTT）试剂盒（Sigma公司）、膜联蛋白V（Annexin V）细胞凋亡检测试剂盒（凯基公司）。

1.2 MCF7细胞的培养与细胞瞬时转染 MCF7细胞于含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 g/L链霉素的DMEM培养基中，37 ℃、5%CO2孵箱内贴壁培养。细胞转染利用转染试剂LipofectamineTM2000，严格按说明书进行，荧光显微镜于转染24 h内观察并估算转染效率。

1.3 免疫组织化学染色 细胞爬片用4%多聚甲醛固定后，在3%过氧化氢-甲醇溶液条件下，常温孵育10 min；10%山羊血清室温孵育10 min；滴加1∶200稀释的兔PDCD4 IgG单抗后，37 ℃孵育1 h；滴加抗兔生物素化二抗50 μL，37 ℃孵育30 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；滴加二氨基联苯胺（DAB）显色液于镜下观察颜色控制时间3 min。复染、脱水、透明、封片。endprint

1.4 MTT检测细胞增殖活性 将细胞分为3组，每组6孔，于转染后l、2、3、4、5、6、7 d测量各组吸光度（A）值，比色时，每孔加MTT溶液（5 g/L）20 μL，37 ℃，继续培养4 h，弃去孔内培养上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min，结晶充分溶解，以空白调零，选择570 nm波长，酶联免疫检测仪测定各孔的A570值，比较各组细胞的增殖抑制率。

1.5 流式细胞仪检测转染后细胞凋亡 按照凋亡试剂盒说明书，转染后48 h按说明书进行操作，检测转染后细胞凋亡。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两样本比较采用配对设计两两比较t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MCF7细胞转染结果 MCF7细胞中较大比例梭型细胞表达绿色荧光蛋白，转染效率（%）=每高倍镜视野发荧光细胞数/同一视野细胞总数×100%，24 h转染效率为（0.834±0.062）%，各组转染效率的比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 免疫组织化学染色结果 镜下3组细胞的形态无明显差异，以细胞质呈棕褐色为阳性细胞，转染pEZX组和未转染组细胞质呈棕褐色；转染pEZX-eGFP-miR-21组结果为阴性。

2.3 MTT法鉴定细胞增殖活性 结果显示，转染组可以明显促进MCF7细胞的增殖。随着培养时间的延长，转染组和空质粒组的细胞数均有所增加，但转染组细胞增殖更快，见图1。

图1 MCF7细胞转染miR-21增殖变化

2.4 细胞凋亡 转染组的凋亡率为（3.14±0.24）%，明显低于空白组、空质粒组的（8.04±0.02）%、（9.41±0.53）%，差异均有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

miRNA是一类由基因组DNA编码，具有高度保守性的非编码小分子RNA片段，它通过与目标mRNA特异性的碱基配对，引起目标mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对基因表达进行调控，参与生命过程中的一系列重要进程，包括早期胚胎发育、细胞周期、细胞凋亡、细胞分化调控、伤口愈合、免疫系统及肿瘤的发生发展[2-3]。miRNA与肿瘤密切相关，半数以上的miRNA编码基因位于肿瘤相关基因位点和脆性染色体区域，在不同肿瘤组织中miRNA异常表达且具有组织特异性[4-6]。研究发现，miR-21在结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、恶性胶质瘤等多种实体肿瘤中的表达上调，尤其是在人高度恶性脑胶质母细胞瘤中，miR-21水平可高出癌旁组织5～10倍[7]。但是，miR-21在个别肿瘤中也会出现低表达，如促肾上腺皮质素分泌型垂体瘤的miR-21表达量较正常垂体组织低2.4倍，这可能是由于miR-21在不同组织中发挥不同的调节功能所致[8]。程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是Shibahara等[9]1995年在小鼠体内发现的一个与细胞周期及细胞凋亡相关的基因。通过原位杂交法测得人PDCD4基因定位于10q24，cDNA全长3.5 kb，其中编码区约1.4 kb[10]。既往多项研究结果表明，PDCD4是一种肿瘤抑制因子，具有促进细胞凋亡、抑制肿瘤生成的作用[11]。Zhang等[12]发现当肝癌细胞系Huh7细胞转染反义PDCD4后，其增殖加速，细胞凋亡受到抑制，提示PDCD4能抑制肝癌细胞系Huh7的增殖，促进其凋亡。Hwang等[13]发现用PDCD4气溶胶治疗肺癌小鼠后，肺癌细胞的生长周期明显延长，凋亡显著加快。Leupold等[14]发现PDCD4能够通过抑制尿激酶受体（u-PAR）的表达，抑制肿瘤新生血管的生成，降低肿瘤的侵袭性，改善患者的预后。在大多数正常组织细胞中，PDCD4蛋白主要位于细胞核，当内环境改变时也可以通过核输出信号而表达于细胞质。研究表明，PDCD4在肺癌、前列腺癌和结肠癌中的表达受到抑制[15]。

本实验结果显示，MCF7细胞转染miR-21后分裂增殖能力增强，细胞凋亡受到抑制，提示miR-21与乳腺癌的进展可能有关，应用免疫组织化学技术检测转染miR-21的MCF7中PDCD4明显降低，与对照组差异有统计学意义，证实PDCD4是miR-21的重要靶蛋白，提示在乳腺癌中，miR-21可能是通过作用于其靶蛋白PDCD4来调节细胞的增殖和凋亡能力，这为进一步研究miR-21在肿瘤发生发展过程中的作用奠定了基础。在乳腺癌中，miRNA-21高表达可能导致抑癌基因PDCD4的失活或低表达，从而促进MCF7细胞的异常增殖，促进乳腺癌的发展，这将为乳腺癌的进一步的靶向治疗提供位点。

参考文献

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（收稿日期：2014-03-05） （本文编辑：欧丽）endprint

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