梅毒螺旋体基因重组抗原及其血清学诊断研究进展

莫显文

导致人体感染梅毒的致病菌为苍白螺旋体的亚种-密螺旋体（TP），感染人体的主要致病菌株为Nichols株。梅毒螺旋体的细胞质被3层细胞质外膜包裹着，而暴露于外膜的跨膜蛋白数量较少，但跨膜蛋白在临床中对于梅毒的诊断确诊有着极大的实际价值[1]。在实际的临床操作中，很难对梅毒螺旋体进行体外培养，确诊梅毒的方式由培养梅毒螺旋体替代为利用梅毒螺旋体的重组抗原进行对应的检测。

1 梅毒螺旋体基因重组抗原的研究进展

1.1 Tpr基因家族 Tpr基因家族涵盖了12个蛋白，这12个蛋白按照同源性氨基酸的分类应该属于3个不同的亚型，其中Ⅰ亚型为Tpr C、D、F、I，Ⅱ亚型为Tpr E、G、J，Ⅲ亚型为 A、B、H、L、K[2]。在这 3 个亚型中，在梅毒感染兔的模型中，诱导T细胞以及强烈的抗体反应的为Tpr K，这一实验结果提示着使用Tpr免疫能够有效地减弱梅毒患者损伤后病情的进一步发展。在分子结构学上，对于Tpr家族的Ⅰ亚型而言，其中它们的C端和N端高度相似于F端和N端，特别是在Tpr的C、D两个亚型之间，它们C端结构的相似度高达94%[3]。在对Tpr家族的抗原氨基末端的重组性实验中发现，这些抗原对于感染梅毒患者的损伤的进展有着一定程度的减弱作用，这些重组抗原很可能起着关键作用的阶段为梅毒患者的不完全免疫阶段。

1.2 TpN15、TpN47、TpN17、TmpA 1989 年 有 学者利用兔子的抗体血清成功的筛查出了Tp基因组中的6个重组克隆，且利用Western法以及电泳法成功的筛选出了TpN15、TmpA、TpN17等3个蛋白[4]。在1996年，相应的学者在通过对梅毒螺旋体的结构的进一步研究中发现，他们利用PCR法对梅毒螺旋体内的基因进行了扩增，并将扩增后的基因插入大肠杆菌内进行了表达，结果获得了TpN47、TpN35、TpN44.5、TpN29-35、TpN39等抗原，接下来的ELISA法实验中发现上述抗原中引起抗体滴度最高的为TpN47、TpN17、TpN44.5[5]。在后续的相关实验中，学者重组并成功表达了TpN47的载体pGEX-2T，并成功证实了其具有免疫原性，同时有学者的相关实验还成功的证实了TpN47是一种能够与青霉素进行结合的蛋白，并且发现TpN47与青霉素结合的位点有3个，同时还证实TpN47本身是一种具有锌依赖性的羧肽。有学者通过重叠多肽的方法成功的找出了位于TpN47上的抗原表位[6]。

1.3 TROMP TROMP对于梅毒具有免疫原性，而在TROMPs的表面可能存在着免疫宿主的介导区和致病力决定区，在TROMP的表面上存在着17-kDa、28-kDa、31-kDa、45-kDa、65-kDa。其中存在于TP内膜原生质体复合物中的主要为17-kDa和45-kDa，而存在于外膜的主要为28-kDa、31-KDa以及65-kDa[7]。在天然重组蛋白质中，28-kDa、31-kDa、65-kDa就天然的具有抗原性质，28-kDa主要在外膜中进行表达，并且与跨膜蛋白存在着高度相似的序列，65-kDa其整体数量虽然较少，但是仍然被认定为具有抗原免疫性，而31-kDa被证明具有能够形成微管的能力，从而被间接的证实为跨膜蛋白。目前国外的相应研究已经明确，TP分子本身的免疫反应能够产生高滴度的TP抗体，在上述反应过程中，TROMPs能够诱导产生对应的抗体。在相关的实验中发现，只有自然的TP感染才能够产生真正的血清吞噬作用，而使用灭活的Tp重组抗原并不能够产生真正意义上的血清吞噬作用[8]。在对TROMP1的各项重组实验中可以发现，在电子显微镜下可以明显发现在Tp感染的血清中，TROMP1的表达主要是在重组菌的表面表达，相应的实验还证实对于rTROMP1而言，其定位于E.coil的外膜，并且同时兼有表面抗原性以及微孔体系。

1.4 Tp0155、Tp0751、Tp0483、Tp0453、Tp92 在1998年的实验中，有学者发现对于Tp92而言，其极有可能是Tp的抗原之一，并通过PET-3a T7载体重组表达了Tp92，通过对表达后的Tp92进行相应的检测发现，Tp92确实具有抗原免疫性[9]。Tp0155、Tp0751、Tp0483、Tp0453都是通过PCR扩增法进行了去除N端信号肽的全长表达，且表达后的这6个蛋白均进行了临床血清学的检测，最后的实验结果显示，对于Tp0155、Tp0751、Tp0483而言，实验的灵敏度为28%~42%之间，而对于Tp0453而言，其中检测的灵敏度和特异度均为100%，Tp92的特异度为97%、灵敏度为98%。其中学者描述了Tp0453的除去两段端肽的结构，但近些年来的实验研究则显示，Tp0453的结构目前与所有已知的外膜蛋白都不相同，Tp0453缺少一种β桶结构，正是因为缺少这种结构，导致Tp0453无法横跨外膜，从而避免暴露于Tp的菌体外膜表面[10]。正是因为Tp0453的这种结构特殊性，有学者认为对于Tp0453极有可能代表一大类的新的细菌外膜蛋白。国内有学者新组了Tp0453并对其进行了临床评价，最后的实验结果显示，Tp0453应该可以被用于ELISA反应[11]。

1.5 Tp4D以及TpN37 在1986年的国外学者的相应实验中就已经证实，对于Tp4D而言，其确实具有抗原免疫性，同时相应的ELISA法也证实，4D的ELISA能够检测到的抗4D特异性抗体为25 ng，且在检测的灵敏度上可以与免疫荧光法相媲美，但是Tp4D的一个重大缺陷就是存在着与地方性梅毒菌种的一个交叉反应[12]。同样在1986年，国外学者使用5.6 kb的TpDNA的重组基因的质粒做出内切酶图谱后，再成功地转入大肠杆菌内进行了表达。利用免疫杂交点的方法对TpN37进行检测时发现，对于梅毒二期的血清检测有效，如果改变检测的方法，利用放免和酶免的方法进行相应的检验，TpN37与所有血清中的抗体都能够发生反应，但唯一的不足是对于阴性对照则没有反应表现出。在兔梅毒模型中，利用兔子血清制作的特异性兔单克隆抗体能够有效地被TpN37抗原，并且TpN37抗原不会与其他的非致病性的螺旋体发生反应，上述实验结果提示对于TpN37而言，其能够有效的作为血清诊断梅毒的有效抗原[13]。

2 梅毒螺旋体基因重组抗原血清学诊断的研究进展

有相应的临床大样本量的实验研究证实，Tp凝血实验的最终结果与利用Tp基因重组抗原的临床快速检测在检测的灵敏度上无显著统计学差异。但Tp单一基因重组抗原对于合并了HIV感染，或者是已经接受了一段时间的抗梅毒治疗的患者，或者是处于潜伏期的梅毒患者而言，其检测的灵敏度会大大下降，而如果使用多基因重组的Tp重组基因抗原，则其检测的整体灵敏度将会大大提高，出现的假阴性的比例会大大减小[14]。

2.1 免疫层析实验的研究进展 利用Tp基因重组的抗原包被膜条测试区时，当抗原中的IgG/IgM与膜条测试区域中的标记的抗人IgG/IgM结合后，结合后的复合物最终层析到膜条测试区与特异抗原结合后所呈现出来的显色标记就为阳性反应标记[15]。在TPHA的评价标准下，有学者将4种不同国家生产的免疫层析试剂盒用来进行评价，结果这4个国家的免疫层析试剂盒的最终检测结果显示，不论是在全血还是在血清检测的敏感性上，都取得了良好的结果，上述的实验结果让人相信在不远的将来，免疫层析实验将有可能取代传统的筛查实验。

2.2 Tp-ELISA的研究进展 在目前的Tp-ELISA研究中，聚苯乙烯反应板微孔在被Tp重组基因抗原包被，且抗人IgG/IgM在被酶标记的情况下，可以有效的对Tp的IgG/IgM进行检测。在双抗原夹心的ELISA法中，酶和反应板均对Tp重组的酶抗原进行了标记。在利用Tp的3种组合表达蛋白，TpN15、TpN17、TpN47的ELISA检测实验与性病研究实验、荧光密螺旋体抗体吸收试验以及TPHA实验的检测灵敏度、特异度相比，利用Tp的3种组合表达蛋白，TpN15、TpN17、TpN47的 ELISA检 测 实 验 的对处于不同分期的梅毒患者的检测的灵敏度、特异度均要显著高于其他3种方法。而国外学者在利用重组的TpN17-15-ELSIA法与WB、以及THBA法相比，在对正常人和含有疾病的2950份血清的检测中，TpN17-15-ELSIA法与WB法均未出现交叉反应，而THBA法则出现了交叉反应[16]。而在对Tp多基因嵌合重组抗原与Tp单基因重组抗原的平行检测中发现，Tp多基因嵌合重组抗原检测的灵敏性要显著高于Tp单基因重组抗原，在对双抗原夹心ELISA法与间接ELISA法的比较中，双抗原夹心ELISA法的检测准确性要显著优于间接ELISA法。而目前在投入商业化使用的Tp重组基因的ELSIA法检测试剂盒中，其检测的灵敏度和特异度均为100%。

2.3 快速乳胶凝集试验 在实验的原理上，快速乳胶凝集试验的基本原理与Tp的颗粒凝集试验相似。在临床实验中，有学者利用TpN15、TpN17、TpN47作做为抗原，利用快速乳胶凝集试验法快速检测了1518份随机得来的血清样本，将检测的实验结果同VDRL法的特异度进行检测，并同时期检测99分梅毒血清样本，最后的实验结果显示，快速乳胶凝集试验与VDRL法检测的特异度并无显著的统计学差异[17]。上述的实验结果提示，在梅毒的筛查中可以考虑使用快速乳胶凝集试验。

2.4 CLIA法 CLIA法的中文名称为化学发光免疫分析，其基本原理为将固相抗原设定为Tp基因重组抗原，利用HRP对第二抗原进行标记，同时使用含鲁米诺或者是其对应的增强剂作为示踪剂，通过最后测量其发光数值的方法来进行检测。我国学者通过使用TpN15、TpN17、TpN47作为对应的酶标抗原和固相抗原，成功的建立了基于Tp为双抗原夹心的CLIA法，通过与TRUST、TPPA、TPHA、Tp-ELISA法 平 行 的 检 测 Tp抗体检测分别呈阳性和阴性的血清，结果最后的实验结果显示这4种方法的阳性检测率和阴性检测率均无显著的统计学差异[18]。

2.5 WB法 将Tp的重组基因抗原通过SDS-PAGE通过电印转印到PVDF膜上，再与待检测的血清进行检测后通过酶标记抗人的IgG/IgM。其实验的基本原理为，如果待检测的血清中存在TpN15、TpN17、TpN42、 TpN47、TpN37等抗体，则加酶的底物可以出现反应，并且能够显色。有国外学者将rpN47、rTpNl7、rTpNl5、rTpN42、rTpN37这5种多肽进行重组建立recWB法，并与MHA-Tp以及wclWB对比进行梅毒血清的检测，相应的实验结果显示，在各项综合指标的评价中，recWB法要显著优于wclWB法[19]。

目前部分Tp重组基因的抗原已经应用于临床梅毒的检测中，其中涉及的Tp基因重组的抗原主要为TpN15、TpN17、TpN47，在初期使用的Tp基因重组抗原多为单一基因的抗原，现在则多为多基因嵌合的抗原，虽然对于各期梅毒的检查灵敏度和特异度得到了极大的提高，但是仍然存在着较大的不足，且在实际中对于何种Tp抗原的检测结果更为准确，仍然存在着较大的争议[20]。目前随着免疫学技术的不断进步与发展，已经逐步能够解决难以从Tp中纯化的微量蛋白数量问题，并已经能够对其具体的作用机制展开相应的研究。这也意味着，Tp基因重组抗原应用于梅毒的检测中的前景更为广阔。

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