无氯仿提取小麦半籽粒DNA的方法

刘永安，潘彬荣，岳高红，梅喜雪，许立奎，张宗宸，周志辉

（1. 浙南作物育种重点实验室温，浙江 温州325006；2. 温州市农业科学研究院，浙江 温州325006）

分子标记是研究小麦遗传和育种的重要技术手段，既可以研究小麦种质资源的遗传多样性，又可以对农艺性状进行辅助选择，具有不受时间限制、针对性强、效率高等优点。通常，用于分子标记的DNA 是从小麦的幼叶中提取的。在研究过程中，虽然可以随时萌发种子获取幼叶用以提取DNA，但小麦的生长受一定季节的限制。如果没有温室等设施，在不适宜小麦播种的季节进行分子标记辅助选择，选择出的目标植株将不能正常生长，甚至不能获得种子，而这些设施正是一些基层科研单位所缺少的。而从远离小麦胚的半粒种子中提取DNA 是解决该问题的有效途径。从半粒种子中提取的DNA 用于分子标记，剩下的半粒种子可适时播种，不需借助温室等设施。

目前，小麦种子DNA 的提取已有较多报道[1-2]。在提取的过程中，通常会用到苯酚、氯仿、异戊醇等试剂。然而，氯仿受公安部门管制，购买时需要公安部门审批[3]，对一些基层科研单位，购买氯仿不但相对困难，而且还比较费时。因此，研究尝试探索一种不用氯仿的小麦籽粒DNA 提取的简单方法，以便为基层科研单位进行小麦分子标记提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以含有Pm21 基因的扬麦18 为研究对象，该材料从江苏省里下河地区农业科学院引进。主要试验试剂有Tris、浓盐酸、EDTA、SDS、NaCl、乙醇、醋酸铵等，以上试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 小麦幼叶DNA 提取 参考柴建芳等[4]的方法提取，但最后不加RNA 酶，该法提取的DNA 作为从籽粒提取DNA 的对照。

1.2.2 有氯仿小麦籽粒DNA 提取 参考董建力等的方法进行提取，该法提取的DNA 作为无氯仿小麦籽粒提取DNA 的对照。

1.2.3 无氯仿小麦籽粒DNA 提取 用刀片切取半粒小麦种子（有胚和无胚），置于1 张干净称量纸上，将称量纸对折以便使小麦籽粒留于中间；用研棒将籽粒研碎，移于1.5 mL 离心管中；加入700 μL DNA 提取缓冲液（100 mmol/L Tris·HCl pH 8.0，50 mmol/L EDTA，500 mmol/L NaCl，2%SDS），65℃水浴约30 min，其间摇匀数次；冷却至室温，于4℃下13 000 rpm 离心15 min；取500 μL 上清液于一新的1.5 mL 离心管中，加入50 μL 10 mol/L 醋酸铵和1 mL 95%乙醇，上下颠倒7～8 次，于4℃下13 000 rpm 离心10 min；弃上清液，加入500 μL 70%乙醇，上下颠倒7～8 次，于4℃下13 000 rpm 离心2 min；弃上清液，于37℃恒温箱中干燥1 h；加50 μL TE缓冲液溶解DNA。

1.2.4 DNA 质量检查 取2 μL DNA 样品与1 μL 6×DNA Loading Buffer 混合，于1%琼脂糖凝胶（含EB）上电泳15 min 检查DNA 质量。

1.2.5 PCR 检测 用多重PCR 检测扬麦18 的3个Wx蛋白亚基（Wx-A1、Wx-B1 和Wx-D1）基因和抗白粉病基因Pm21，其反应体系及扩增条件参考许立奎等[5]的方法，引物序列及预扩增条带见表1。

表1 引物序列及其预扩增片段

2 结果与分析

2.1 DNA 质量检测

由图1 可知，3种提取方法都能得到DNA 条带，但不同方法所取得的DNA 量有所不同，从叶片中提取的和用氯仿提取的DNA 浓度较高，没有用氯仿提取的DNA 浓度较低。同时，有研究表明不同提取方法和小麦籽粒不同部位提取RNA 的浓度有显著差异，从叶片中提取的和从有胚半粒小麦种子中提取的RNA 的浓度较高，从无胚半粒小麦种子提取RNA 的浓度较低。另外，从叶片中提取的RNA 片段较小，用有氯仿方法从有胚半粒种子提取的RNA 片段较大，而用无氯仿方法从有胚半粒种子提取RNA 片段呈现较为均匀的弥散状态。

图1 小麦籽粒不同提取方法DNA 凝胶电泳图谱

2.2 多重PCR 检测

如图2 所示，用各种方法提取的DNA 进行扩增，基本都能得到目标条带Wx-D1（204 bp）、Wx-A1（265 bp）、Wx-B1（854 bp）和Pm21（1 400 bp），但其多重PCR 结果有明显差异，主要表现在目标条带Wx-D1（204 bp）和Pm21（1 400 bp）亮度的差异。从叶片中提取的DNA 扩增效果最好，各目标条带都较亮；用氯仿提取的半粒种子DNA 扩增效果稍差，泳道2（有氯仿有胚半粒提取DNA）的Wx-D1（204 bp）条带不明显；没有用氯仿提取的半粒种子的DNA 扩增效果也较差，从有胚和无胚半粒种子提取DNA 扩增的Pm21（1 400 bp）都较暗，这可能与模板DNA 浓度较低有关。

图2 不同DNA 样品多重PCR 扩增结果凝胶电泳图谱

3 讨论

研究所用的无氯仿小麦籽粒DNA 提取方法，与以前的研究相比，所需试剂没有氯仿，操作步骤少了“氯仿-异戊醇或苯酚-氯仿-异戊醇抽提”这一环节，具有所需试验试剂容易获取、操作步骤简单快捷等优点。与传统的氯仿提取方法相比，虽然该方法所得的DNA 浓度较低，但一样可用作PCR 扩增模板。

该研究用多重PCR 进行检测，与一般PCR 相比，具有所需试剂少、通量高、经济等优点[9]，但也存在对模板DNA 质量要求高、引物设计困难、不同扩增片段存在竞争等问题[10]。用无氯仿提取法所得到DNA 为模板，可扩增出所有目标条带，说明该DNA 提取方法具有较好的实用性。不过，用该方法提取的DNA 为模板，所扩增出的Pm21（1 400 bp）条带较暗，需增加上样量或用聚丙稀酰胺凝胶电泳检测，以得到更为理想的效果。因此，无氯仿小麦籽粒DNA 提取方法可在对DNA 质量要求不高以及氯仿无法及时得到时使用，尤其适合基层科研单位使用。

[1]董建力，张增艳，王敬东，等.用于PCR分析的小麦种子DNA微量快速提取[J].种子，2007，26（5）：10-12.

[2]任 强，张增艳，黄 鹏.半粒小麦种子DNA提取的研究[J].甘肃农业大学学报，2010，45（4）：59-62.

[3]苗翠英，张 晶.论走私、贩卖易制毒化学品案件的特点及防范对策[J].公安大学学报，2002，（1）：92-96.

[4]柴建芳，刘 旭，贾继增.一种适于PCR扩增的小麦基因组DNA快速提取法[J].植物遗传资源学报，2006，7（2）：246-248.

[5]许立奎，潘彬荣，岳高红，等.抗白粉病糯性小麦的多重PCR分子鉴定技术[J].核农学报，2014，28（7）：1203-1207.

[6]Shariflou M R，Sharp P J.A polymorphicmicrosatellite in the 3’end of‘waxy’genes ofwheat，Triticum aestivum[J].Plant Breeding，1999，118（3）：275-277.

[7]刘迎春.小麦Wx基因的分子标记及其应用[D].南京：南京农业大学，2004.

[8]Liu Z，Sun Q，Ni Z，et al.Development of SCAR markers linked to the Pm21 gene conferring resistance to powderymildew in common wheat[J].PlantBreeding，1999，118（3）：215-219.

[9]陈明洁，方 倜，柯 涛，等.多重PCR——一种高效快速的分子生物学技术[J].武汉理工大学学报，2005，27（10）：33-36.

[10]黄银花，胡晓湘，徐慰倬，等.影响多重PCR扩增效果的因素[J].遗传，2003，25（1）：65-68.