活检骨骼肌对肌糖原累积病的诊断价值

贺宏梅 ，靳陶然 ，李娜 ，赵哲 ，邴琪 ，李楠 ，胡静

活检骨骼肌对肌糖原累积病的诊断价值

贺宏梅a，靳陶然b，李娜a，赵哲a，邴琪a，李楠a，胡静a

目的：总结肌糖原累积病（MGSD）临床与活检骨骼肌的病理特点。方法：回顾性分析16例MGSD患者的临床和骨骼肌病理资料。结果：临床表现包括肌力下降、运动不耐受、肌痛、肌张力减低等，可合并多系统受累；血肌酸激酶不同程度升高；肌电图正常或呈肌源性/神经源性损害。活检骨骼肌病理分析：典型病理表现为细胞浆内散在不定形空泡和/或PAS染色空泡内糖原流失或蓄积；2例酸性磷酸酶活性增加；1例磷酸化酶活性缺失；电镜下可见大量糖原颗粒聚集，MGSDⅡA病患者可见双膜自噬泡、髓样小体、溶酶体聚集和糖原颗粒蓄积。结论：骨骼肌活检对MGSD诊断与鉴别诊断具有重要价值；细胞浆内糖原空泡、糖原蓄积是重要病理诊断依据，酸性磷酸酶、磷酸化酶特殊染色有助于分型诊断，指导致病基因测序；电镜下溶酶体髓磷脂样改变支持MGSDⅡA型诊断。

肌糖原累积病；骨骼肌活检；组织化学染色；病理分析

糖原累积病（glycogen storage disease，GSD）是一组单基因遗传代谢性疾病，基因突变导致其编码的糖原转化相关酶缺陷，代谢底物堆积、供能障碍继而引发多器官受累，于1928年首次报道[1]，发病率1/20 000～1/43 000[2]，根据致病基因、缺陷酶的不同可分为13种亚型[3]，以骨骼肌损害为主的称为肌糖原累积病（muscle glycogen storage disease，MGSD），包括Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ型，主要表现为进行性加重的肌无力和运动不耐受、痛性肌痉挛、周期性横纹肌溶解等症状。本研究回顾性分析16例MGSD患者的临床、病理资料，讨论骨骼肌活检病理对MGSD诊断的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

在我院神经肌病科遗传标本库（2004年9月至2013年9月）中筛选MGSD患者16例。

1.2 方法

1.2.1 总结患者一般资料、临床表现、肌酸激酶、电生理及病理结果。

1.2.2 活检骨骼肌冰冻切片组织化学、酶学染色病理分析 ①标本获取及处理：根据临床资料和肌电图结果选取活检部位，签署知情同意书后行骨骼肌开放式活检，标本快速液氮冷冻用于光镜分析。②光镜分析：骨骼肌标本7μm冰冻连续切片，苏木精-伊红 （hematoxylin-eosin，HE）、改良 Gomori三色（modified gomori trichrome，MGT）、还原型辅酶Ⅰ四氮唑还原酶、琥珀酸脱氢酶、单磷酸腺苷脱氨酶、细胞色素C氧化酶、酸性磷酸酶、肌磷酸化酶、腺苷三磷酸环化酶（pH=4.35，4.65，9.95）、高碘酸 Schiff反应（periodic acid schiff，PAS）、油红 O、苏丹黑B染色，光镜下分析。

1.2.3 活检骨骼肌透射电镜超微病理分析 活检骨骼肌标本1μm超薄切片，经4%戊二醛固定、磷酸缓冲液冲洗，再经1%锇酸固定，再次磷酸缓冲液冲洗，丙酮梯度脱水。醋酸铀和柠檬酸铅双重电子染色，于透射电子显微镜下分析。

2 结果

2.1 临床表现

16例MGSD患者中男13例，女3例；就诊年龄为1.4～38岁，平均21岁；发病年龄为0.1～36岁，平均17岁；均表现为肌力下降；近端肌为著9例，肌力为Ⅲ－～Ⅳ＋级；远端肌为著1例，肌力为Ⅳ－级；远近端肌力均减弱6例，肌力为Ⅱ～Ⅴ－级；伴肌张力减低7例；伴运动不耐受3例；伴肌痛3例；伴呼吸系统受累1例（表1）。

2.2 辅助检查

血肌酸激酶（creatine kinase，CK）升高9例，波动于 144～2 886 U/L，平均1 070U/L。肝功能谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和谷丙转氨酶（alanine transam inase，ALT） 升高 3 例，AST波动于 56～640 U/L，平均 349 U/L；ALT波动于60～640 U/L，平均309 U/L。肝脏彩超示脂肪肝2例。心脏超声示左室收缩功能减低和室壁运动异常2例。心肌核素显像示左室下壁灌注减低2例。肌电图示肌源性异常10例，神经源性异常1例（表1）。

2.3 活检骨骼肌病理分析

2.3.1 组织化学、酶学染色病理分析 HE和MGT染色显示，14例肌纤维细胞浆内可见典型空泡，空泡大小不一、数目不等、形态不规则，2例未见典型空泡；2例MGSDⅡA型肌纤维细胞浆中空泡类似“肥皂泡”样改变，HE染色空泡内含嗜碱性颗粒样物质，MGT染色呈紫红色；PAS染色显示16例肌纤维细胞浆可见空泡（糖原流失）和粉红色深染（糖原蓄积），树脂包埋、半薄切片PAS/甲苯胺蓝染色显示空泡处糖原蓄积呈粉红色深染；2例MGSDⅡA型细胞浆内酸性磷酸酶活性增高呈红染；1例MGSDⅤ型磷酸化酶活性缺失（表 2、图 1）。

2.3.2 透射电镜超微结构病理分析 1例MGSDⅡA型肌原纤维间糖原颗粒蓄积、溶酶体聚集、呈双膜自噬泡、髓样小体，线粒体结构异常、Z线和肌原纤维网结构紊乱、缺如；8例MGSD仅见肌膜下或肌原纤维间糖原颗粒聚集，糖原聚集区域肌原纤维缺如，线粒体结构紊乱（表2、图2）。

3 讨论

MGSD多呈常染色体隐性遗传，其中Ⅱ型又称为MGSDⅡA，由位于溶酶体内的酸性麦芽糖酶缺陷所致，溶酶体与细胞自噬密切相关，其内酸性麦芽糖酶缺陷可导致糖原降解受阻，在引发自噬的同时影响正常自噬过程的进行[4]，从而导致细胞死亡。Ⅲ、Ⅴ和Ⅶ型分别因糖原脱支酶、肌磷酸化酶、肌磷酸果糖激酶缺乏所致，三者均位于细胞浆，糖原代谢受阻、异常产物堆积是导致细胞死亡的主要原因。

MGSDⅡ型主要累及肌肉和心脏，重症患者常并发呼吸功能衰竭。婴儿型表现为典型的松软儿综合征，可伴有心脏肥厚、呼吸系统感染等，病例1、2与上述报道一致。MGSDⅢ型近端肌无力可与肝脏症状同时或先后出现，肝脏症状随着年龄增长而好转，多于青春期后消失，也可仅于成年后表现为无力。MGSDⅤ、Ⅶ型仅累及肌肉，主要表现为运动不耐受、肌痛、肌痉挛。与Ⅶ型区别的是Ⅴ型表现为继减活动阳性，不合并高尿酸血症和溶血性贫血。病例8符合上述表现。

表1 16例肌MGSD患者临床资料

表2 16例MGSD患者病理资料

图1 MGSD患者骨骼肌病理组织化学及酶学染色结果

图2 MGSD患者骨骼肌病理透射电镜检查结果（×20 000）

血CK、电生理检查在MGSD中无特异性。甲状腺功能、C反应蛋白、血沉、血乳酸检查对除外代谢相关性肌病、炎性肌病、线粒体肌病具有重要辅助作用。

MGSD病理特征性改变为大小不一、数目不等、形态不规则的空泡样结构/粉红色深染（糖原蓄积）。特异性酶化学染色可提示分型诊断[3,5]。病例1、2病理形态学呈空泡如“肥皂泡”样，HE/MGT染色空泡内可观察到嗜碱性/紫红色颗粒样物质；PAS染色呈空泡和粉红色深染，酸性磷酸酶活性增高。符合典型的MGSDⅡA型病理表现。病例8病理形态学呈形状不规则空泡，PAS染色呈空泡和粉红色深染，树脂包埋后PAS染色示空泡部位糖原蓄积呈粉红色深染，肌磷酸化酶活性缺失，符合典型MGSDⅤ型病理改变。

基因4q35的突变可导致空泡病理像的出现[6]，以空泡为主要病理改变的肌病包括MGSD、脂质沉积病、包涵体肌炎、伴镶边空泡的远端肌病[7]、遗传性包涵体肌病等，但各种空泡病理上有所区别：MGSD空泡形状多不规则，PAS染色可见空泡内糖原聚集。脂质沉积病空泡多呈类圆形或裂隙状，油红O染色可见空泡内脂质沉积。后三者表现为HE染色周边呈嗜碱性，MGT染色镶紫红边的边缘空泡，刚果红染色下可见空泡周边呈红色无结构物质沉积。此外，尚有多种肌病可伴有空泡出现，但多为继发改变，以其它病理形态学改变作为主像，提示诊断分型。Danon病是一种酸性麦芽糖酶活性正常的溶酶体贮积症，病理上主要表现为细胞浆内有嗜碱性颗粒状物质沉积[8]，可偶见微小空泡，其PAS、酸性磷酸酶染色均呈阳性，易与MGSDⅡ型相混淆，免疫组化抗C5b-9阳性作为其特有表现，可有效鉴别[8]。

MGSD电镜可见糖原颗粒聚集于肌膜下或肌原纤维间[3,9-11]，MGSDⅡA型特异性表现为双膜自噬泡、髓样小体和溶酶体聚集[9,10]。糖原颗粒聚集无特异性，也可见于其它骨骼肌肌病导致的肌纤维变性。双膜自噬泡和自噬碎片可提示自噬受阻，大量自噬碎片说明预后不良，酶替代疗法效果差[12]。因此电镜具有辅助MGSD诊断的意义，对明确发病机制和预后，指导治疗具有重要作用。

MGSD病理提示糖代谢异常所致异常产物堆积和供能障碍引发临床症状。因此有效治疗方案应以改善糖类代谢、补充蛋白质为主，酶替代疗法是目前研究的热点。肌细胞出现大量空泡可提示MGSD，如未出现空泡且其他表现不明显可结合PAS染色综合分析。有研究表明酸性磷酸酶染色阳性的球状物质沉积可成为缺乏典型空泡表现的GSDⅡ成人型的诊断标志物[13]。

除MGSD外，同样表现为松软儿综合征的疾病还包括先天性肌营养不良、先天性肌病和脊髓性肌萎缩症等。其中表现为运动不耐受、肌痛的包括线粒体肌病、脂质沉积病、内分泌肌病和炎性肌病等，表现为缓慢进行性加重的四肢近端肌无力的包括进行性肌营养不良、脂质沉积病和炎性肌病等。但各种肌病骨骼肌活检病理各有其特征表现，可进行有效鉴别。

通过对酸性麦芽糖酶、糖原脱支酶活性的测定可分别确诊MGSDⅡ型和Ⅲ型[14]。分子生物学检测是MGSD诊断的重要标准，病理诊断可提示部分致病基因测序方向（MGSDⅡ、MGSDⅤ），病理分型不明的MGSD可依据多系统受累症状体征，分析可能的致病基因进行测序，或直接基因芯片、高通量测序完成最终诊断，进一步遗传咨询、产前诊断。

MGSD临床表现复杂，诊断困难，活检骨骼肌病理分析对其诊断及鉴别诊断具有重要价值，值得临床推广。

[1]Simon van Creveld.The Clinical Course of Glycogen Disease[J].Can Med Assoc J,1963,88:1-15.

[2]Özen H.Glycogen storage diseases:New perspectives[J].World J Gastroenterol,2007,13:2541-2553.

[3]Hicks J,Wartchow E,M ierau G.Glycogen storage diseases:a brief review and update on clinical features,genetic abnormalities,pathologic features,and treatment[J].Ultrastruct Pathol,2011,35:183-196.

[4]Fukuda T,Ewan L,Bauer M,et al.Dysfunction of endocytic and autophagic pathways in a lysosomalstorage disease[J].Ann Neurol,2006,59:700-708.

[5]Schoser BGH,Müller-Höckert J,Horvath R,et al.Adult-onset glycogen storage disease type 2:clinico-pathological phenotype revisited[J].Neuropathol ApplNeurobiol,2007,33:544-559.

[6]Reilich P,Schramm N,Schoser B,et al.Facioscapulohumeral muscular dystrophy presenting with unusual phenotypes and atypicalmorphological features of vacuolarmyopathy[J].J Neurol,2010,257:1108-1118.

[7]赵哲,胡静.远端型肌病/肌营养不良:临床、病理、分子生物学研究进展[J].神经损伤与功能重建,2013,8:313-317.

[8]Morisawa Y,Fujieda M,Murakami N,et al.Lysosomal glycogen storage diseasewith normal acidmaltasewitHearly fataloutcome[J].JNeurol Sci,1998,160:175-179.

[9]Lewandowska E,W ierzba-Bobrow icz T,RolaR,et al.Pathology of skeletalmuscle cells in adult-onset glycogenosis type II(Pompe disease):ultrastructural study[J].Folia Neuropathol,2008,46:123-133.

[10]Hudgson P.The value of electron microscopy inmuscle biopsies[J].Proc RSoc Med,1970,63:470-474.

[11]Ryman BE.The glycogen storage diseases[J].JClin Pathol Suppl(RColl Pathol),1974,8:106-121.

[12]Chien YH,Lee NC,Huang PH,et al.Early pathologic changesand responses to treatment in patients with later-onset pompe disease[J].PediatrNeurol,2012,46:168-171.

[13]Tsuburaya RS.,Monma K,Oya Y,et al.Acid phosphatase-positive globular inclusions is a good diagnostic marker for two patients with adult-onset Pompe disease lacking disease specific pathology[J].Neuromuscul Disord,2012,22:389-393.

[14]Taglia A,Picillo E,D'Ambrosio P,etal.Genetic counseling in Pompe disease[J].ActaMyol,2011,30:179-181.

Diagnosis Value of Skeletal M uscle Biopsy for M uscle G lycogen Storage Disease

HE Hong-mei,JIN Tao-ran,LINa,ZHAO Zhe,BING Qi,LINan,HU Jing.Departments ofNeuromuscularDisease,The Third HospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang 050051,China

Objective:To summary the clinical and skeletal muscle biopsy pathological features of muscle glycogen storage disease.Methods:The clinical and pathological data of the 16 cases ofmuscle glycogen storage disease(MGSD)were retrospectively analyzed.Results:The clinicalmanifestations includemuscle weakness,exercise intolerance,myalgia,and muscle tonus reducing which may be accompanied by multitude systems involvement.Serum creatine kinase was increased at varying degrees.Electromyography showed normal or myogenic or neurogenic damage.Typical pathology manifestation was unshaped vacuoles in the cytoplasm of muscle fibers,glycogen washed away or accumulated in the vacuoles in PAS staining.The activities of acid phosphatasewere increased in two cases.The activity of phosphorylasewas absent in one case.Many glycogens were accumulated under electronmicroscope.MGSDⅡA patients showed doublemembrane autophagy gathered vacuoles,myeloid bodies,lysosomes gathered and glycogen granules.Conclusion:Skeletal muscle biopsy pathology analysisplaysan important roleon diagnosisand differentialdiagnosis.Glycogen vacuolesand accumulation in the cytoplasm ofmuscle fibers are important pathology diagnosis evidence.Special staining such as acid phosphatase and phosphorylase is helpful in classification diagnosis and guiding causative gene sequencing.Lysosomemyelin-like change supportsMGSDⅡA disease diagnosisunderelectronmicroscope.

muscle glycogen storage disease;skeletalmuscle biopsy;histochemicalstain;pathologicalanalysis

R741;R741.04;R746.9

A

DOI10.3870/sjsscj.2014.05.011

河北医科大学第三医院 a.神经肌肉病科b.干部病房 石家庄 050051

2014-04 -06

胡静

Jinghu5510@163.com

（本文编辑：王晶）