6－姜酚降低血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞衰老的机制研究

周艳芳，张国辉，王 好

（江苏大学附属人民医院心研所，江苏镇江212002）

细胞衰老是不可逆的细胞周期停滞伴随表型的改变，呈现特征性的衰老表型，包括细胞增大、扁平等细胞形态改变、衰老相关的β－半乳糖苷酶活性增加［1］等。细胞衰老不仅仅是生理上促进组织、器官及机体的衰老，还具有促进衰老相关疾病的发生发展。因此，靶向抑制细胞衰老可能是衰老相关疾病防治的有效新策略［2－3］。细胞衰老与坏死一样是不可逆过程，有效降低其衰老是关键。目前，认为一些酚类物质治疗可能有效，6－姜酚是一种生姜中的多酚复合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的多重保护效应［4－5］，且中国有饮生姜水祛老年斑（皮肤衰老表现）的民间验方。血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是高血压、冠心病等衰老相关性血管疾病发生发展的重要病理因素，有研究显示AngⅡ能通过AT1受体介导血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）衰老［6］，作者实验证明mTOR参与AngⅡ 诱导的VSMCs衰老。在本试验中，作者以AngⅡ作为VSMCs衰老诱导剂，探讨6－姜酚对AngⅡ介导VSMCs衰老的干预作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 体质量120～150g的雄性SD大鼠，由江苏大学动物实验中心提供。

1.2 药物与试剂 DMEM培养基及胰蛋白酶（Gibco，美国），南美胎牛血清（HyClone，美国），AngⅡ（Tocris，美国），6－姜酚（Merck，德国），细胞衰老相关的β－半乳糖苷酶检测试剂盒（碧云天，中国），RNaseA、碘化丙啶（Amresco，美国），兔单克隆mTOR抗体、磷酸化P70－S6K抗体（Cell Signal Technique，美国）及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（Cell Signal Technique，美国），山羊多克隆AT1抗体及辣根过氧化物酶标记驴抗山羊IgG（Santa Cruz，美国），超敏ECL显色试剂盒（Pierce，美国）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠主动脉VSMCs的分离培养及处理 取体质量120～150g的雄性SD大鼠，断头处死，无菌条件下取胸主动脉，纵向剪开，剥离血管外膜及内膜，中膜剪成1～3mm大小组织块，采用组织块贴壁法培养VSMCs，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2、100%湿度的标准条件下培养细胞，获得纯度90%以上的VSMCs（免疫细胞化学抗α－SMA染色）。第3～8代的细胞用于实验，给予AngⅡ处理细胞（AngⅡ组），或以6－姜酚预处理细胞1h，再给予AngⅡ处理（6－姜酚组）。然后进行细胞衰老相关的β－半乳糖苷酶染色检测细胞衰老，流式细胞术分析细胞周期，或提取蛋白进行蛋白免疫印迹法（Western blot）分析蛋白表达。

1.3.2 β－半乳糖苷酶染色 按试剂说明书的步骤进行，经处理48h的6孔板中培养的细胞，吸除细胞培养液，PBS洗1次，加1mLβ－半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min，PBS洗3次。每孔加1mL染色工作液，37℃孵育过夜，相差纤维镜下（×400）观察并摄片。分别选择8～10个视野，计数衰老和正常细胞数（共计数100个），计算衰老阳性率［衰老细胞阳性率（%）＝衰老阳性细胞数／100个细胞×100%］。

1.3.3 流式细胞术检测细胞周期变化 细胞以2×104个密度接种于6孔板，培养24h，用药物处理到设定的时间，以0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，1 000×g离心5min，PBS洗涤3次，500μL预冷的70%乙醇4℃过夜固定。PBS洗涤2次，100μL的PBS重悬细胞，加入RNaseA（终浓度100μg／mL），37℃孵育30min，加入碘化丙啶染色液（终浓度50μg／mL），常温避光染色1h，200目滤网过滤，流式细胞仪（美国BD公司FACS Calibur）检测分析细胞周期变化。

1.3.4 Western blot检测 收集各组细胞，加入冰冷细胞裂解液100μL（5倍细胞球体积），静置30min，超声粉碎4次，13 000r／min离心30min，提取总蛋白并用Bradford法测蛋白浓度，40μg蛋白上样行十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE），再将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2h，加一抗4℃过夜。二抗室温孵育1h，ECL化学发光显色后凝胶成像仪（Bio－Rad公司，美国）捕获图像。

1.4 统计学处理 采用SPSS16.0软件进行统计分析，计数资料以率（%）表示，组间率的比较采用χ2检验；计量资料以s表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD方法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 6－姜酚降低AngⅡ诱导的VSMCs衰老 β－半乳糖苷酶活性被证明是衰老细胞的一个特征性的生物标志物［7］。作者以1×10－6mol／L AngⅡ处理细胞48h，β－半乳糖苷酶染色结果显示：未经刺激的细胞偶见染色阳性细胞，AngⅡ刺激后染色阳性细胞数量及染色程度显著增加，与AngⅡ刺激的细胞相比较，6－姜酚预处理的细胞β－半乳糖苷酶染色阳性细胞数量及染色程度均随6－姜酚浓度升高而显著降低，见图1，表1。表明6－姜酚可以保护VSMCs抵抗AngⅡ诱导的细胞衰老。以下的机制探讨中均以终浓度1×10－5mol／L的6－姜酚作为干预条件。

图1 β－半乳糖苷酶染色结果（X－Gal法，×400）

表1 不同浓度AngⅡ 对VSMCs衰老的影响（n＝3）

2.2 6－姜酚对AngⅡ处理的VSMCs细胞周期的影响 细胞周期停滞是衰老细胞的一个显著特征，VSMCs经AngⅡ（10－6mol／L）处理 48h后 G0／G1期停滞的细胞由对照的60.77%上调至82.50%，而S期则由14.23%降至6.35%，显著低于对照组（P＜0.05）；6－姜酚（10－5mol／L）干预后则G0／G1期细胞下调至63.40%，S期上调至11.22%，见图2。

2.3 6－姜酚对AT1受体表达的影响 有研究证明AngⅡ通过其AT1受体介导细胞衰老，本实验显示 AngⅡ（10－6mol／L）刺激的细胞 AT1表达上调，6－姜酚（10－5mol／L）预处理未影响AngⅡ诱导的AT1蛋白表达。6－姜酚处理对正常培养的细胞AT1表达水平亦无显著影响，见图3。

图2 6－姜酚对AngⅡ处理的VSMCs细胞周期的影响

图3 6－姜酚对AngⅡ诱导的AT1受体蛋白表达的影响

2.4 6－姜酚对mTOR蛋白表达及底物P70－S6K磷酸化水平的影响 单独6－姜酚处理的细胞与对照细胞比较，mTOR表达及P70－S6K磷酸化水平差异无统计学意义（P＞0.05）；但与单独 Ang Ⅱ （10－6mol／L）刺激的细胞比较，6－姜酚（10－5mol／L）预处理的细胞mTOR表达水平则显著降低（P＜0.05）；AngⅡ刺激而升高的P70－S6K磷酸化水平显著回落，见图4。

图4 6－姜酚预处理对AngⅡ诱导的mTOR蛋白表达及P70－S6K蛋白磷酸化水平的影响

3 讨 论

生姜具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤作用，6－姜酚是生姜的主要活性成分之一，是一种多酚复合物；体外细胞及动物实验显示6－姜酚除有抗炎、抗氧化效应，还具有抗血小板、降脂、降压等多重心血管损伤保护作用［8］。本研究利用AngⅡ诱导的VSMCs衰老模型显示6－姜酚能显著抑制模型细胞的衰老样表型改变（图1），表明6－姜酚可保护VSMCs抵抗AngⅡ诱导的细胞衰老，这利于VSMCs保持正常的细胞功能进而维持血管稳态。AngⅡ通过AT1受体介导VSMCs衰老［6］，而本研究6－姜酚处理对AngⅡ诱导的AT1受体表达并无显著影响（图3），提示6－姜酚降低AngⅡ诱导的VSMCs衰老可能不依赖于AT1受体，而是作用于受体后信号分子。mTOR作为细胞生长代谢中的一个中心控制者［9］，除可通过磷酸化使其下游底物活化而调节细胞代谢、生长及存活等，还可调节一些细胞型的衰老过程［10－11］，是衰老相关疾病治疗的潜在靶点［12］。本研究结果显示6－姜酚可以显著抑制AngⅡ诱导的mTOR升高（图4）及底物P70－S6K磷酸化，提示抑制 mTOR／P70－S6K途径可能是6－姜酚保护VSMCs抵抗AngⅡ诱导的细胞衰老的机制之一。该结果与最近报道的mTOR抑制剂雷帕霉素抵抗某些细胞或动物衰老的结果一致［13－15］，提示6－姜酚可能有一定的类雷帕霉素的抗衰老作用。生姜是中国人民普遍使用的调味食物，价廉而又不良反应少，易于推广使用，这为衰老相关心血管疾病的防治提供了一个非常有益的提示。当然本实验探讨了生姜主要活性成分之一的6－姜酚对体外VSMCs衰老的影响，进一步深入研究生姜及其主要成分对血管细胞衰老的影响及在体内效果可能会发掘出生姜这一食用植物对血管衰老的确切防治作用，并产生意想不到的现实意义。

总之，本研究就6－姜酚在VSMCs衰老的作用进行了初步研究，结果显示6－姜酚可降低AngⅡ诱导的VSMCs衰老，该作用可能部分是通过抑制mTOR／P70－S6K而实现，6－姜酚的这一作用为衰老相关的心血管疾病的防治提供了新的思路。

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