膜蛋白AN01过表达对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株生物学特性的影响

李雅冬

重庆医科大学附属第一医院颌面外科，重庆 400016

·论 著·

膜蛋白AN01过表达对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株生物学特性的影响

李雅冬

重庆医科大学附属第一医院颌面外科，重庆 400016

电话：023-89012907，电子邮件：llxxyydd2006@sina．com

目的研究膜蛋白ANO1过表达对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖、剥脱、伸展和迁移的影响。方法以ANO1稳定过表达的Hep-2细胞株作为实验组，空白质粒转染的Hep-2细胞作为对照组，采用MTT法检测细胞增殖活性，细胞剥脱实验检测细胞剥脱能力，细胞伸展实验检测细胞伸展能力，Boyden小室侵袭实验、体外划痕愈合实验和尼氟灭酸阻断氯离子通道实验检测细胞迁移能力。结果MTT法检测结果显示，实验组与对照组的光密度值差异无统计学意义(P=0．62)。细胞剥脱实验和细胞伸展实验结果显示，实验组的细胞剥脱百分比 (P＜0．0001)和伸展百分比 (P＜0．0001)明显大于对照组。Boyden小室侵袭实验结果显示，实验组的穿膜细胞百分比明显大于对照组 (P＜0．0001);体外划痕愈合实验结果显示，实验组的划痕面积百分比明显小于对照组 (P＜0．0001);尼氟灭酸阻断氯离子通道实验结果显示，实验组的划痕面积百分比明显大于对照组 (P＜0．0001)。结论ANO1过表达并未加快癌细胞的增殖速度，但却大大增加了头颈鳞癌细胞的移动、伸展和剥脱能力。

头颈鳞癌;氯离子通道;转移

Acta Acad Med Sin，2014，36(1)：20-24

癌细胞转移是头颈鳞癌治疗失败的主要原因［1］。笔者以往采用基因芯片技术检测了80例头颈鳞癌患者的临床标本，结果发现ANO1高表达与头颈鳞癌转移高度相关［2］。对多株头颈鳞癌细胞株的检测结果亦显示，人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞内源性ANO1表达较低。遂将含有ANO1片段的PSG-5质粒转染入Hep-2细胞，成功建立了ANO1稳定高表达的Hep-2细胞。本研究评估了膜蛋白ANO1过表达对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖、剥脱、伸展和迁移的影响，以期为今后的体内实验打下良好的基础。

材料和方法

材料稳定高表达ANO1的人喉鳞状细胞癌Hep-2和空白质粒转染的Hep-2细胞由笔者构建;MTT检测试剂盒、DMSO、MEM培养基、胎牛血清和PBS粉剂购自美国Sigma公司;流式细胞仪购自德国Heraeus公司，YG-875型超净工作台购自美国Bio-Rad公司，倒置光学显微镜购自日本Olympus公司。

细胞增殖实验采用MTT法测定Hep-2细胞的增殖。以稳定高表达ANO1的人喉鳞状细胞癌Hep-2作为实验组，空白质粒转染的Hep-2细胞作为对照组，取对数生长期细胞，用0．25%胰蛋白酶消化后，制成单细胞悬液，然后接种到96孔板内，使每孔细胞数为2000，每24 h检测1次，共9 d，检测前于每孔内加入MTT(5 mg/ml)10 μl，放入CO2孵箱中孵育4 h，去上清，每孔加入异丙醇与0．04 mol/L盐酸的混合物150 μl，震荡1 h后，再利用酶联免疫检测仪在570 nm波长处比色，每次检测至少6孔，最后取其平均值。

细胞伸展实验采用4株稳定高表达ANO1的人喉鳞状细胞癌Hep-2作为实验组，3株空白质粒转染的Hep-2细胞作为对照组 (细胞剥脱实验和体外划痕愈合实验分组情况同上)，将单细胞悬液接种到6孔板内，每孔106个细胞，用1个倒置显微镜每30 min收集1次图像，2 h后计数伸展和未伸展细胞，最后算出细胞伸展百分比。细胞伸展百分比=伸展细胞数/(未伸展细胞数+伸展细胞数) ×100%，每株细胞的伸展实验均被重复3次。

细胞剥脱实验将单细胞悬液接种到6孔板内，每孔106个细胞，孵育2 d后，用0．02%胰蛋白酶在常温下消化10 min，磷酸盐缓冲液洗涤2次，收集剥脱的细胞，然后计数剥脱和黏附细胞，最后算出细胞剥脱百分比。细胞剥脱百分比=剥脱细胞数/(未剥脱细胞数+剥脱细胞数) ×100%，每种细胞的剥脱实验均被重复3次。

Boyden小室侵袭试验将Boyden小室放入每孔加有500 μl含10%胎牛血清的6孔培养基中，Boyden小室中加入500 μl含10%胎牛血清，取各组细胞密度为4×105/ml的悬液200 μl加入Boyden小室，37℃孵育4 h。然后取出Boyden小室，将Boyden小室倒置，滤膜下层向上，PBS洗涤，3%戊二醛固定，染色，用棉花棒擦净小室滤膜上层未侵袭的细胞。最后使用倒置显微镜进行观察和拍照。以穿膜细胞百分比表示肿瘤细胞的侵袭能力。

体外划痕愈合实验将细胞重复接种于2个24孔板，待细胞长满孔底，用200 μl的一次性塑料吸头在孔底做划痕，每孔内均加入5 μmol/L阿非迪霉素，以阻止细胞分裂增殖。在32 h内，用1个倒置显微镜收集图像，放大倍率 ×40，利用Adobe Photosho PCS2测量划痕两侧边缘之间的距离和面积，划痕面积百分比=现划痕面积/始划痕面积×100%。细胞迁移速度=(始划痕两侧边缘之间的距离-现划痕两侧边缘之间的距离)/时间 (μm/min)。

尼氟灭酸阻断氯离子通道实验取对数生长期稳定高表达ANO1的人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞，将细胞重复接种于2个24孔板，待细胞长满孔底，用200 μl的一次性塑料吸头在孔底做划痕，每孔内均加入5 μmol/L阿非迪霉素。并在一个24孔板内每孔加入100 μmol/L尼氟灭酸 (氯离子通道阻断剂)作为实验组，另一个板内每孔加入尼氟灭酸溶剂0．1%DSMO作为对照组。观察方法和指标同体外划痕愈合实验。

统计学处理采用SPSS 10．0统计软件，实验数据以均数±标准差表示，细胞增殖实验和尼氟灭酸阻断氯离子通道实验数据分析采用方差分析，细胞伸展实验、细胞剥脱实验和Boyden小室侵袭实验数据分析采用t检验，体外划痕愈合实验数据分析采用秩和检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

细胞增殖实验结果实验组与对照组的细胞增殖情况差异无统计学意义 (F=0．27，P=0．62)(表1)。

细胞伸展实验结果实验组伸展细胞百分比分别为 (42±18)%、(50±12)%、(82±9)%和 (75±10)%，对照组分别为 (36±6)%、(21±7)%和(33±6)%，两组相比差异有统计学意义 (t=39．97，P ＜0．0001)(图1)。

图1 培养90 min后ANO1过表达对Hep-2细胞伸展的影响(×400)Fig 1 Effect of ANO1 overexpression on cell spreading of Hep-2 cells after 90 min(×400)

细胞剥脱实验结果实验组剥脱细胞百分比分别为 (92．0 ±1．0)%、(85．0 ±2．0)%、(80．0 ±1．0)%和 (91．0±2．0)%，对照组分别为 (36．0 ±5．0)%、(39．0 ±0．2)% 和 (36．0 ± 1．0)%，两组相比差异有统计学意义 (t=62．34，P ＜0．0001)(图2)。

Boyden小室侵袭实验结果实验组穿过滤膜的细胞百分比为 (54±5)%，是对照组 ［(26±1)%］的2倍，差异有统计学意义 (t=16．22，P＜0．0001)。

体外划痕愈合实验结果32 h后，实验组划痕面积百分比为0，明显低于对照组的30%(F=39．89，P＜0．0001); 实验组细胞平均迁移速度为 (0．16±0．03)μm/min，明显高于对照组的 (0．12 ±0．02) μm/min(t=4．84，P=0．0007)(表2、图3)。

尼氟灭酸阻断氯离子通道实验结果32 h后，对照组划痕面积百分比为0，明显低于实验组的20%(F=155．97，P＜0．0001);对照组细胞的平均迁移速度为 (0．16±0．03) μm/min，明显高于实验组细胞的(0．12 ±0．02) μm/min(t=4．76，P=0．0009) (表3、图4)。

图2 ANO1过表达对Hep-2细胞剥脱的影响 (×100)Fig 2 Effect of ANO1 overexpression on cell detachment of Hep-2 cells(×100)

表1 ANO1过表达对Hep-2细胞增殖的影响Table 1 Effect of ANO1 overexpression on Hep-2

表2 ANO1过表达对Hep-2细胞迁移的影响 (%)Table 2 Effect of ANO1 overexpression on cell migration of Hep-2 cells(%)

表3 尼氟灭酸对Hep-2细胞迁移的影响 (%)Table 3 Effect of niflumic acid on cell migration of Hep-2 cells(%)

图3 ANO1过表达对Hep-2细胞迁移的影响 (×40)Fig 3 Effect of ANO1 overexpression on cell migration of Hep-2 cells(×40)

图4 尼氟灭酸对Hep-2细胞迁移的影响 (×40)Fig 4 Effect of niflumic acid on cell migration of Hep-2 cells(×40)

讨 论

已知ANO1属膜蛋白，具有8个穿膜片段，在ANO1的2个保守区域中，有1个区域参与有丝分裂。人ANO1包含26个外显子，位于人11号染色体长臂1区3带的 CCND1-EMS1基因座内，编码与C12orf 3、C11orf 25及FLJ34272基因产物同源的8-跨膜蛋白，11号染色体长臂1区3带的基因是人类基因组中最常发生扩增的基因之一。本研究以ANO1稳定过表达的Hep-2细胞株作为实验组，空白质粒转染的Hep-2细胞作为对照组，检测了细胞的增殖活性，结果显示，ANO1的高表达不会显著影响细胞在指数增长阶段的增殖，说明ANO1对于肿瘤的生长并没有显著的促进作用。

已知肿瘤发生转移的过程可分为以下几个步骤：局部生长浸润、从瘤体剥脱、迁移入血管或淋巴管、随血液或淋巴循环系统转移、迁移出血管或淋巴管、在新的部位伸展定居并生长增殖，可见瘤细胞的剥脱，迁移和伸展能力对肿瘤转移是相当重要的［3-4］。本研究采用Hep-2细胞株分别进行了细胞剥脱实验、细胞伸展实验、Boyden小室侵袭实验和体外划痕愈合实验，结果表明ANO1高表达会促进细胞剥脱、伸展和迁移，提示ANO1高表达可能是通过提高细胞的剥脱、伸展和迁移能力，最终促进头颈鳞癌的转移。该结果与Ruiz［5］等研究结果一致，同时也验证了本研究的前期实验结果。

氯离子通道在细胞迁移过程中可发挥重要作用。在细胞头部，通过Na+/H+和Cl-/HCO3-的交换，以及Na+-HCO3-的联合转运，细胞头部胞内渗透压变大，导致细胞头部伪足的体积膨胀，向前移动，而逐渐膨胀的伪足还可导致细胞膜张力变大，从而激发细胞尾部钙离子通道的开放，细胞内钙离子浓度升高，诱发氯离子外流，细胞尾部胞内渗透压降低，致使细胞尾部体积回缩，最终完成细胞整体向前移动。2008年，Schroeder等［6］、Caputo 等［7］和 Yang 等［8］分别发表了关于利用膜片钳法证明ANO1具有需钙离子激活的氯离子通道活性的论文，这一发现为ANO1与癌症的研究提出了新方向，即ANO1离子通道活性是否参与了癌细胞的迁移。本研究采用尼氟灭酸阻断氯离子通道，结果表明细胞的迁移变慢，充分说明ANO1需钙离子激活的氯离子通道活性参与了细胞的迁移运动。当ANO1高表达，细胞膜上的钙离子和氯离子通道增多，钙离子和氯离子跨膜转运会增多，从而导致胞内渗透压的节律变化加快，促进了细胞的迁移。目前已有多项研究证实氯离子通道在肿瘤细胞的迁移过程中发挥了重要的作用［9-14］，而阻断离子通道，有时会带来意想不到的疗效［15］，目前氯离子通道属尚未开发的药物靶点，其抑制剂正在研究开发之中［16］。

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［3］Mendoza P，Ortiz R，Díaz J，et al．Rab5 activation promotes focal adhesion disassembly，migration and invasiveness in tumor cells［J］．J Cell Sci，2013，126(Pt 17)：3835-3847．

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［5］Ruiz C，Martins JR，Rudin F，et al．Enhanced expression of ANO1 in head and neck squamous cell carcinoma causes cell migration and correlates with poor prognosis［J］．PLoS One，2012，7(8)：e43265．

［6］Schroeder BC，Cheng T，Jan YN，et al．Expression cloning of TMEM16A as a calcium-activated chloride channel subunit［J］．Cell，2008，134(6)：1019-1029．

［7］Caputo A，Caci E，Ferrera L，et al．TMEM16A，a membrane protein associated with calcium-dependent chloride channel activity ［J］．Science，2008，322(5901)：590-594．

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Effects of Membrane Protein ANO1 Stable Overexpression on Laryngocarcinoma Hep-2 Cells

LI Ya-dong

Department of Oral and Maxillofacial Surgery，First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

Tel：023-89012907，E-mail：llxxyydd2006@sina．com

ObjectiveTo explore the effects of ANO1 overexpression on the proliferation，detachment，spreading，and migration of laryngocarcinoma Hep-2 cell line．MethodsANO1-overexpressing Hep-2 cell line was selected as the assay group，and Hep-2 cell line with empty plasmid was selected as the control group．MTT assay was used to detect the proliferation abilities of Hep-2 cells in both two groups．Cell detachment assay and spreading assay were used to detect the detachment and spreading abilities of Hep-2 cells．Boyden chamber invasion assay，wound healing assay in vitro，and niflumic acid block chloride channel were used to detect the migration abilities of Hep-2 cells．All data were analyzed by SPSS 10．0 software package．ResultsCell proliferationassay by MTT showed that，compared with the control group，the optical density value of assay group was not significantly different(P=0．62) ．The results of cell detachment assay and cell spreading assay showed the cell detachment rates and cell spreading rates in assay group were significantly higher than those in control group(P＜0．0001) ．The results of Boyden chamber invasion assay showed the percentages of cells migrating through the membrane in assay group were significantly higher than those in control group(P ＜0．0001) ．The results of in vitro wound healing experiments showed the wound area rate in assay group was significantly lower than that in control group(P ＜ 0．0001) ．The results of niflumic acid blocking chloride channel experiments showed the wound area rates in assay group were significantly higher than those in control group(P ＜0．0001) ．Conclusion ANO1 overexpression does not remarkably alter the proliferation rate of cancer cells，but increases the migration，spreading，and detachment capacities of head and neck squamous cell carcinoma．

head and neck squamous cancer;chloride channel;metastasis

R782．2

A

1000-503X(2014)01-0020-05

10．3881/j．issn．1000-503X．2014．01．004

重庆市自然科学基金 (cstc2012jjA10039)、重庆市卫生局医学科研项目 (2011-2-013)和重庆市教委科学技术研究项目 (KJ130318)Supported by the Natural Science Foundation Project of CQ CSTC(cstc2012jjA10039)，the Medical Research Project of Chongqing Municipal Health Bureau(2011-2-013)，and the Science and Technology Research Project of Chongqing Municipal Commission of Education(KJ130318)

2013-10-23)