交联玻璃酸钠注射液中残留交联剂乙烯砜的测定

王悦，李京，范慧红

（中国食品药品检定研究院，北京 100050）

交联玻璃酸钠注射液中残留交联剂乙烯砜的测定

王悦，李京，范慧红Δ

（中国食品药品检定研究院，北京 100050）

目的建立交联玻璃酸钠注射液中交联剂乙烯砜和其水化产物1，4-噻恶烷-1，1-二氧残留量的测定方法。方法用乙醇萃取样品，乙烯砜和其水化产物溶于乙醇，玻璃酸钠不溶于乙醇生成白色沉淀，取上清液直接进样，用气相色谱仪分析。色谱柱为Agilent DB-wax（30m×0.53mm，1.0μm）；分别使用氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）和火焰光度检测器（flame photometric detector，FPD）进行测定并对比结果。结果FID测定乙烯砜和其水化产物的线性范围分别为0.5～20μg／mL和2～100μg／mL；定量限分别为2.6μg／mL和7.6μg／mL；检测限分别为0.8μg／mL和2.3μg／mL；加样回收率分别为104.3%和92.4%。FPD测定结果与FID测定结果差异无统计学意义。结论使用FID已可以满足检验需要，该方法灵敏、快速、专属性强，可用来同时控制产品中痕量的乙烯砜和其主要水化产物1，4-噻恶烷-1，1-二氧。

交联玻璃酸钠；乙烯砜；乙烯砜水化物；1，4-噻恶烷-1，1-二氧；气相色谱法

本文研究用样品为两步交联后的混合物，组分A为甲醛交联生成的可溶性凝胶，组分B为A组分经乙烯砜二次交联的不溶性凝胶，2者经一定比例混合，产品分子量约6 000 kDa。交联玻璃酸钠分子量大小、理化性质等与选择的交联剂类型、交联剂浓度和交联时间均有关系［11］，但如乙烯砜等交联剂多具有较强的毒性［12-13］，交联步骤时交联剂的浓度与反应时间均应严格控制，其在产品中的残留量也应被严格控制。在交联反应中，乙烯砜除可以与玻璃酸钠的糖链发生反应外，还可与水发生副反应，主要副产物为 1，4-噻恶烷-1，1-二氧（1，4-Thioxane-1，1-dioxide，TD）和 2-2′磺酰基二乙醇（Sulfonyl Diethanol，SD），因此在控制乙烯砜残留量的同时还应控制其水化产物的含量。2-2′磺酰基二乙醇较不稳定，在高温下会转化为1，4-噻恶烷-1，1-二氧。本文旨在建立一种可以同时测定乙烯砜和1，4-噻恶烷-1，1-二氧2种化合物的气相色谱方法。考虑到供试品质地黏稠且有不溶颗粒，本文分别考察了超滤离心和乙醇萃取的样品处理方式。另外，本文还分别考察了对含硫化合物高灵敏的FPD检测器和较为普及的FID检测器对测定结果的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 Agilent 7890A气相色谱仪（Agilent7693自动进样器，FPD检测器，安捷伦科技有限公司）；氢空一体机（中惠普分析技术研究所）；HP 6890 plus气相色谱仪（HP 7683自动进样器，FID检测器，惠普公司）。

VS为国产分析纯试剂；TD购于美国Alfa Aesar公司，纯度≧99%；乙醇购自DikmaPure，色谱纯。交联玻璃酸钠注射液共6批（批号：P12062、N12015、W11132、X11262、P1217、Q12161），由Genzyme Biosurgery公司提供。

1.2 溶液制备

1.2.1 内标溶液：准确称取二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）适量，稀释制成20μg／mL的溶液。

1.2.2 对照品溶液：准确称取 VS、TD适量，稀释制成1 000μg／mL的贮备液。分别取2种贮备液适量，稀释成含VS、TD分别为2μg／mL、10μg／mL的混合溶液，精密量取0.9mL，加入0.1mL内标溶液和2mL乙醇，混匀。

1.2.3 供试品溶液：称取供试品0.9 g，加入0.1mL内标溶液和2mL乙醇，密塞，混匀，室温放置至沉淀完全后，取上清液，0.45μm滤膜过滤。

1.3 色谱条件 色谱柱：Agilent DB-WAX（30m×0.53mm，1.0μm）；载气为高纯氮气；升温梯度：（起始温度140℃，维持2min；以25℃／min的速率升至170℃；再以35℃／min的速率升至240℃，维持1.7min）；流速为15mL／min；FID检测器及 FPD检测器；进样口温度为210℃；检测器温度为300℃。

2 结果

2.1 专属性试验 按照1.2.2和1.2.3方法，配制不含VS、TD的阴性溶液，分别进样1μL，记录色谱图，结果均无空白干扰。内标物、VS、TD 3个色谱峰之间分离度均能够符合要求。

2.2 线性关系、定量限及检测限考察 精密吸取VS贮备液、TD贮备液适量，稀释成含 VS分别为 0.5、1、2、5、10、20μg／mL，含 TD分别为2、5、10、20、100μg／mL的混合溶液，各取1mL，加入2mL乙醇，摇匀，作为系列线性溶液。吸取上述线性溶液1μL进样，分别用FID、FPD检测器进行测定，记录峰面积。以对照品的质量浓度X（μg／mL）为横坐标，峰面积或峰高Y为纵坐标进行线性回归，分别得出VS、TD在两种检测器下的回归方程。将混合对照品逐级稀释，以信噪比为3和10时，得VS、TD的检测限和定量限（见表1）。

表1 回归方程、定量限及检测限结果Tab.1 Regression equations，LOD and LOQ of VS and TD

2.3 精密度试验 取含2μg／mLVS、10μg／mLTD的混合对照溶液1μL，注入气相色谱仪，连续进样6次，记录峰面积。使用FPD检测器得到的VS和TD的RSD分别为3.3%和3.2%；使用FID检测器得到的VS和TD的RSD分别为1.1%和2.0%。

2.4 加样回收率 称取9份已测定含量的样品0.9 g，精密称定。由于已测样品中未检出VS和TD残留，因此2种化合物的加入量均按照其拟定限度值的80%、100%、120%设置，配制成低、中、高3个浓度的混合对照品溶液。分别向样品中加入混合对照品溶液0.1mL，充分混匀，每个浓度平行3份，分别加入2mL乙醇，混匀，取上清液进样1μL，用FID检测器记录峰面积，计算加样回收率，由表2结果可见，VS、TD的平均回收率均在80%～120%范围内，该方法的准确度可靠。

表2 加样回收率试验结果Tab.2 Sample recovery test results

2.5 实际样品测定 将6批供试品分别按照1.2.3方法配制。取对照品溶液和供试品溶液各1μL进样，用FID（图1）和FPD检测器（图2）分别测定，记录峰面积，按外标法计算供试品溶液中VS、TD残留量，结果均未检出。

图1 FID检测器测定对照品（a）和供试品（b）溶液色谱图Fig.2 The chromatography of standard solution（a）and sample solution（b）detected by FID

图2 FPD检测器测定对照品（a）和供试品（b）溶液色谱图Fig.3 The chromatography of standard solution（a）and sample solution（b）detected by FID

3 讨论

3.1 样品处理方式 使用乙烯砜交联后的玻璃酸钠样品，多呈不溶性凝胶状，无法采用直接进样的方式。乙烯砜和其水化物的沸点较高，不能采用顶空进样的方式。因此本研究采用乙醇萃取样品的方式，使玻璃酸钠形成白色沉淀，同时乙烯砜及水化物易溶于乙醇，可直接进样进行测定。本研究所用样品是可溶性A组分与不溶性B组分的混合物，本文曾摸索过采用截留Mw≧10k的超滤管离心超滤，弃去不溶部分，将滤出液直接进样测定的方法，但研究发现滤出液体积与超滤管品牌、批次，离心转数与离心时间均有关系，滤出液体积与样品加入量之间不能准确换算。另外，滤液直接进样后，小分子量的玻璃酸钠会对TD的检测造成干扰，必须采用FPD检测器才能消除。

3.2 萃取液体积 样品中VS、TD的残留量较低，加入2mL乙醇作为萃取液可以萃取完全。本文曾将样品溶液弃去上清后，取沉淀物进行二次萃取试验，二次萃取液中未检出残留VS、TD，说明2mL萃取液体积已可以满足实验需要。

3.3 检测器选择 FPD是对含硫、磷的化合物具有高灵敏性、高专属性的检测器，从图1－2可以看出基线较为平整，不受样品和载气杂质的干扰，但也正是由于高专属性，其普及性较差。本文的研究表明，由于样品基质已采用乙醇沉淀，可以采用FID检测器，且检出限和定量限已可以满足测定要求，与FPD相比无显著性差异。

3.4 标准限度 乙烯砜有很强的毒性，其残留量应被严格控制。乙烯砜在交联工艺步骤中与水反应生成的水化产物，毒性较乙烯砜降低。在综合考虑企业质控限度、待测样品的残留量、残留交联剂的毒性及检测所用方法的灵敏度后，本研究将乙烯砜残留的上限定为2 ppm，将其水化产物的限度定为10 ppm。

以往的研究都只关注于乙烯砜交联剂本身［14-15］，对于其水化产物并未控制。本研究建立的方法可以同时测定乙烯砜及其主要水化产物1，4-噻恶烷-1，1-二氧的量。本研究还比较了FID检测器和专属性测定含硫化合物的FPD检测器对于2者的测定结果，结果表明FID检测器已可以满足日常测定需求。本研究建立的方法操作简便、准确度高，为乙烯砜交联剂残留量的质量控制提供了依据。

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（编校：吴茜）

Determ ination of residual cross-linker vinyl sulfone in sodium hyaluronate injection

WANG Yue，LIJing，FAN Hui-hongΔ

（National Institute for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

ObjectiveTo establish a method to quantify the residual cross-linker vinyl sulfone and its hydration product 1，4-Thioxane-1，1-Dioxide.MethodsThe polysaccharidewas precipitated by ethanol，however vinyl sulfone and its hydration productwere soluble，and can be analyzed by direct injection.The analysiswas carried on Agilent DB-wax capillary column（30m×0.53 mm，1.0μm）.The flame ionization detector（FID）and flame photometric detector（FPD）were used to detect samples and the efficiency were compared.ResultsThe linear range of vinyl sulfone and its hydration productwere separately 0.5～20μg／mLand 2～100μg／mL detected by FID.The Limit of Quantity（LOQ）were 0.8μg／mL and 2.3μg／mL，respctively.The Limit of Detection（LOD）were 2.6μg／mLand 7.6μg／mL，respectively，and the average recoveries（n＝9）of them were 104.3%and 92.4%，respectively.ConclusionFID could meet the needs of the test，and this method is simple and accurate with high sensitivity and good repeatability，which can be used for quality control of trace vinyl sulfone and its hydration products 1，4-Thioxane-1，1-Dioxide in cross-linked sodium hyaluronate injection.

cross-linked sodium hyaluronate injection；vinyl sulfone；hydration product of vinyl sulfone；1，4-Thioxane-1，1-Dioxide；Gas Chromatography

TQ460.72

A

1005－1678（2014）04－0171－04

玻璃酸钠（sodium hyaluronate）在自然界中多存在于眼球晶状体，关节腔黏液，皮肤、动脉管壁、脐带等结缔组织、鸡冠以及某些细菌的夹膜中。它是一种天然直链黏多糖类物质，其二糖单元是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖以-1，3糖苷键构成，重复的二糖单元以β-1，4糖苷键连接形成糖链［1］。

天然玻璃酸钠分子量较小，在体内易被降解，半衰期较短，在体内仅能维持几天［2］。为解决这一问题，可采用不同交联剂将天然玻璃酸钠交联在一起，增强其结构强度［3］及抗降解能力，从而延长其在体内维持时间［4-5］。目前常用交联剂有甲醛、戊二醛［6］、碳二亚胺（carbodiimide）［4］、乙烯砜（vinyl sulfone，VS）［1］和1，4-丁二醇二缩水甘油醚（1，4-Butanediol Dimethanol Diglycidyl Ether，BDDE）［7］。其中乙烯砜交联产品目前广泛应用于预防术后组织粘连［8］、组织工程［9］、组织填充［10］以及关节腔润滑。然而目前各国药典均未收载该品种，我国也尚无该品种的国家标准，各企业的质量标准中对乙烯砜残留的控制方法、限度均有所不同，亟待建立合理规范的方法和标准。

王悦，女，硕士，助理研究员，研究方向：多糖类药物质量控制；范慧红，通信作者，女，研究员，研究方向：生化药物的质量控制，E-mail：shenghuayaoshi＠126.com。