非霍奇金淋巴瘤患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的检测及临床意义

李 颖 付 蓉

(1天津医科大学总医院，天津 30005；2济宁医学院附属医院，山东 济宁 272029 )

非霍奇金淋巴瘤(NHL)是发生于淋巴结及或结外淋巴组织的恶性肿瘤，其发生发展与免疫功能异常密切相关。近年来的研究均表明 CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(regulator T cells，Tregs)在肿瘤环境中会有一定比例的增加，可使肿瘤免疫发生失调情况，导致肿瘤的发生[1-3]。但 Tregs 在淋巴瘤中的作用尚无定论。本文采用流式细胞术检测 NHL 患者与健康人外周血 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 的比例，比较 NHL 患者与正常人外周血 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例的差异及 NHL 患者化疗前后 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例的变化，探讨外周血 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 水平与 NHL 的预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2013年4月至2013年12月收治的初诊NHL(B细胞型)病例共38例为观察组，包括弥漫大B细胞淋巴瘤18例，滤泡性淋巴瘤7例，黏膜相关淋巴组织淋巴瘤6例，脾边缘区淋巴瘤4例，套细胞淋巴瘤3例，所有患者均符合WHO2008 NHL诊断标准、临床及随访资料完整。其中男性21例，女性17例，年龄22～71岁，平均年龄为(45.2±8.9)岁；同时选取同期健康志愿者20例作为对照组，均为性别、年龄匹配，无自身免疫性疾病、肿瘤病史，近期无感染病史。

1．2 化疗方法与疗效评价指标

所有 NHL 患者均参照《NCCN 2012非霍奇金淋巴瘤临床实践指南》进行6周期化疗，化疗方案包括：CHOP、CHOEP、R-CHOP、hyperCVAD (其中C：环磷酰胺；H：阿霉素，O：长春新碱；P：泼尼松；E：足叶乙甙；R：利妥昔单抗；D：地塞米松)。化疗后完全缓解(CR)标准：肿瘤完全消失超过1个月；部分缓解(PR)标准：病灶的最大直径及其最大的垂直直径的乘积减少50%以上,无新发病灶，持续超过1个月。化疗6周期后均采用 CT 检测。

1．3 检测方法

1．3．1仪器及试剂 流式细胞仪(BD FACSC Calibur)，CD4-FITC、CD8-PE、CD3-APC、CD25-PE，Foxp3 APC，固定剂、破膜剂及各荧光抗体对应同型对照均购自美国Becton Dickinson公司，淋巴细胞分离液购自于国药集团化学试剂有限公司。

1．3．2标本采集 正常对照组及研究组患者均于清晨采集空腹静脉血10ml，其中NHL组在化疗6周期后再次采血10ml，肝素抗凝，均在6h内检测。

1．3．3标本处理及检测 1)抗凝血用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，用PBS调整PBMC为细胞悬液(浓度：1×106～5×106/ml)。2)取4支试管编号为1、2、3、4，分别加入100 μl PBMC细胞悬液，1号管分别加入CD4-FITC、CD8-PE、CD3-APC抗体各20μl；2号管分别加入CD4-FITC CD25-PE抗体各20μl，避光孵育30min。1号管、2号管分别加入溶血素2ml，避光孵育10min，300g离心5min，弃上清，PBS洗涤1次后重悬，1号管待上机。2号管加2ml新鲜配制固定液，涡旋混匀，避光30min，500g离心5min，弃上清，PBS洗涤1次后重悬，加0.5ml破膜剂，混匀，避光45min，300g离心5min，弃上清，加20μl Foxp3-APC抗体，涡旋混匀，避光孵育60min，加入2ml PBS，500g离心5min，弃上清，加500μl PBS重悬，立即上机检测，3号管为膜抗体同型对照，4号管为胞内抗体同型对照，同1、2号同时进行标记。3)经BD FACSDiva软件分析得出测定数据。

1．4 统计学方法

所得数据采用SPSS18．0进行统计学分析。

2 结果

2．1 观察组患者化疗前和对照组外周血T细胞亚群的比较

观察组患者化疗前和对照组相比，外周血CD3+、CD4+细胞中比例及CD4+/CD8+均明显降低，CD8+、CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例明显升高,差异有统计学意义(P<0．05)。见表1。

表1 观察组患者和对照组外周血T细胞亚群的比较

2．2 观察组患者化疗前后外周血T细胞亚群的比较

化疗后完全缓解及部分缓解的观察组患者外周血中CD8+、CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例较化疗前明显降低，CD3+、CD4+细胞比例及CD4+/CD8+较化疗前均明显升高，且差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2．3 化疗后完全缓解与部分缓解观察组患者之间的外周血T细胞亚群比较

化疗后达到完全缓解的患者(CR)和部分缓解的患者(PR)之间，CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例及CD4+/CD8+无显著差异，(P>0.05)。见表3。

表2 NHL患者化疗前后外周血T细胞亚群的比较

表3 化疗后完全缓解和部分缓解患者之间的外周血T细胞亚群比较

3 讨论

Tregs是指一类具有免疫调节功能的T细胞，在维持机体免疫自稳、调控免疫应答方面起重要作用。1975年日本学者发现了抑制性 T 细胞可妨碍有效的抗肿瘤免疫[4]，Sakaguchi等[5]证实在自身免疫性疾病中，CD4+CD25+调节性T细胞亚群通过抑制性调节 CD4+和 CD8+T 细胞对免疫起负调节作用。Foxp3是forkhead/winged-helix转录因子家族成员。研究表明，Foxp3 是CD4+CD25+T细胞的特异性分子，是后者细胞发育和成熟的调控因子，也是其发挥抑制和调节功能必不可少的分子[6-7]。因此，目前均以CD4+CD25+Foxp3+T细胞定义Tregs。CD4+CD25+Foxp3+Tregs 主要通过分泌IL-10、TGF-β等[8]抑制性细胞因子，通过细胞接触依赖的抑制途径与效应性T细胞竞争性结合 IL-2 或直接作用，抑制其增殖并促进其无能、诱导抗原提呈细胞向免疫耐受的方向发展、抑制免疫效应细胞向肿瘤局部聚集，这些方面抑制免疫效应细胞的功能，促使肿瘤细胞免疫耐受、逃逸。

Marshall等[9]首次发现在Hodgkin 淋巴瘤患者浸润淋巴细胞和外周血单核细胞中CD4+CD25+Tregs 数目增加。随后的研究表明，在淋巴瘤、淋巴细胞白血病等多种恶性血液系统肿瘤患者体内的Tregs数量升高，降低 Tregs数量可以有效地激活机体对肿瘤细胞的免疫应答，提高患者的长期生存期[1-3]。但Tregs与淋巴瘤的关系尚存在争议。

我们采用 CD4、CD25、Foxp3 联合标记法检测38例初诊NHL患者及20例正常成人外周血 Tregs 占 CD4+T 细胞的比例，结果提示初诊 NHL患者较正常成人对照组外周血 Tregs 比例升高，且差异具有统计学意义，该结果与 Mittal S等[9]的研究结果一致。我们的观察结果提示：在初诊的NHL患者中，存在 CD4+CD25+Foxp3+Tregs介导的免疫抑制状态，这种状态可能导致了机体免疫系统对早期突变的恶性淋巴瘤细胞的免疫忽视或免疫应答减弱，从而使免疫系统失去了对恶性淋巴瘤细胞的清除能力，导致了淋巴瘤的发生及疾病进展。

为了进一步观察Tregs与NHL预后之间的关系，本文同时比较了NHL患者化疗前后外周血 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例的变化，发现化疗后达到CR、PR患者较治疗前外周血 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例明显下降，提示接受有效治疗患者的免疫抑制状态得到一定纠正，其细胞免疫功能恢复，从而抑制肿瘤生长或杀灭肿瘤。但在化疗后达到 CR 与 PR 的患者之间 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 的比例无明显差异(P>0.05)。由于本研究中NR 的患者例数较少，无法有效评估NR患者外周血中Tregs的变化，Tregs是否与NHL患者的不良预后及原发耐药有关，仍需要进一步的研究证实。

本文结果显示CD4+CD25+Foxp3+Tregs 在NHL的发生、发展方面中具有重要作用，有可能作为预后和临床治疗的监测指标。但其作用机制比较复杂，而 Tregs 在不同NHL亚型中的作用存在差异，能否作为NHL的独立预后指标仍需要深入开展大样本的临床研究加以证实。

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[9] Marshall NA，Christie LE，Munro LR，et al．Immunosuppressive regulatory T cells are abundant in the reactive lymphocytes of Hodgkin lymphoma[J]．Blood，2004，103(5)：1755-1762．