内皮型一氧化氮合酶基因启动子-786位点多态性与原发性高血压发病相关性的研究

刘永生 郑立文 武国东

临床研究

内皮型一氧化氮合酶基因启动子-786位点多态性与原发性高血压发病相关性的研究

刘永生 郑立文 武国东

作者单位：130062 吉林省长春市，解放军第208医院心内科（刘永生、郑立文）；吉林大学第一临床学院心内科（武国东）

目的 研究内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因启动子-786位点多态性与原发性高血压发病的相关性，同时研究此位点多态性与原发性高血压的程度及血压节律是否相关。方法 采用病例对照研究的方法，以232例原发性高血压患者与130名健康中老年人的血白细胞为样本，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术检测两组的eNOS基因启动子-786位点T/C多态性，比较两组的基因型和等位基因的分布频率。高血压组内按高血压的危险分层分为低危、中危、高危组分别为89、78、65例，按血压节律性分为杓型与非杓型组分别为109、123例，比较各组eNOS基因启动子-786位点的基因型和等位基因的分布频率。结果 eNOS基因启动子-786位点T/T、T/C和C/C基因型在高血压组中分别为22.84%、50.87%、26.29%，在正常中老年人组中分别为36.15%、53.08%、10.77%，此位点高血压组与正常中老年人组的基因分布频率差异有统计学意义。eNOS基因启动子-786位点T/T、T/C和C/C基因型在高血压低危、中危、高危各组中分布频率无显著差异，在依据血压节律的分组中差异也无统计学意义。结论 ①eNOS基因启动子-786位点与原发性高血压发病有一定程度的相关性；②eNOS基因启动子-786位点T/T是原发性高血压的保护性基因；③eNOS基因启动子-786位点的基因型与原发性高血压的程度及血压节律改变无明显相关性。

内皮型一氧化氮合酶； 原发性高血压； 基因； 遗传多态性

随着近年人口老龄化及人们生活水平的提高，原发性高血压的发病率明显升高。未得到理想控制的高血压可严重影响心、脑、肾等人体重要脏器的结构与功能，使高血压具有较高的致残率和致死率，现已公认为“无声健康杀手”[1]。因此在基因水平探讨原发性高血压的发病相关因素已成为必然。已有诸多研究证实，一氧化氮（NO）血浆水平与原发性高血压患者的血压水平等因素存在某种相关性[2]，因而NO的代谢在原发性高血压的病因研究中值得深入探讨，而NO合成的限速酶基因也就自然成为原发性高血压病因的候选基因。本试验就是着重研究内皮型NO合成酶（eNOS）基因多态性与原发性高血压发病及其轻重程度的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 高血压组：2009年4月至2011年12月于解放军208医院心内科门诊初诊的原发性高血压患者，经各项相关辅助检查排除继发性高血压、糖尿病、重度贫血、甲状腺功能亢进、肾炎、高血钾、严重心肾功能不全和冠心病，经评估极高危原发性高血压患者不纳入本试验，儿童、妊娠妇女以及近期有脑出血、脑梗塞患者也为本试验的排除对象。试验对象共计232例，均自愿加入本试验研究，其中男性110例，女性 122例，年龄（56.59±12.39）岁。对照组：同期于我院体检中心体检的中老年人，经各项检查排除原发性高血压及糖尿病，自愿参与本试验，共计130例，男性68例，女性62例，年龄（54.98±13.02）岁。以上两组间男女比例及年龄均经统计学检验示无明显差异。全部试验对象均为汉族，且相互间无血缘关系。

高血压组内分组：依据血压水平、危险因素和靶器官受累程度[3]将高血压患者分为低、中、高危三组，分别为89、78、65例，三组间男女比例及年龄均经统计学检验示组间无明显差异，具有可比性。极高危患者不作为本试验对象。

动态血压分析：高血压组试验对象均行24 h动态血压监测，监测设置日间血压（6：00-22：00）和夜间血压（22：00-6：00），30 min测量 1次，24 h有效血压读数＞85%，如有效血压读数≤85%则重新监测。监测仪可自动记录并统计各时间段（24 h、日间、夜间）收缩压（SBP）、舒张压（DBP）平均值及相应时间段内血压均值的标准差（standard deviation，SD）。根据夜间血压与白昼血压相比是否下降≥10%或 10 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），分为杓型高血压及非杓型高血压。SBP昼夜差值百分比=（昼SBP均值－夜SBP均值）/昼SBP均值×100%。杓型组SBP昼夜差值百分比≥10%～19%；非杓型组SBP昼夜差值百分比＜10%。高血压组患者经如上检查分为动态血压杓型组109例及非杓型组123例。按血压节律所分两组间男女比例及年龄均经统计学检验示组间无明显差异，具有可比性。

1.2 模板DNA的制备 所有试验对象均采集空腹肘静脉血4 ml，用EDTA-K2抗凝，采用已建立的碘化钠裂解、氯仿及戊醇提取法[4]提取白细胞基因组DNA，-30℃保存备用。

1.3 引物合成 引物均由上海生物工程有限公司合成，应用Printer引物设计软件设计一对引物，用于扩增eNOS启动子区的一段DNA序列。上游引物：5’－ATGCTCCCACCAGGGCATCA－3’，下游引物：5’-GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG-3’。

1.4 扩增条件 为扩增eNOS基因启动子-786区，PCR反应体系为30 μl，其中含有已提取模板DNA 100 ng，10×PCR 缓冲液 3.0 μl，Taq 酶（上海生工生物工程有限公司产品）2.0 U，15 mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷（dNTPs）0.5 μl，上、下游引物各1 μl。PCR反应条件为：97℃预变性5 min，然后94 ℃ 45 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。4℃保存。以上所用主要仪器为Primus25型PCR仪。

1.5 扩增产物的限制性酶切及电泳 取PCR扩增产物 10 μl，用 10UNgOAIV 酶（Prpmega Corporation公司）于37℃酶切16 h。反应终止后，产物经3%琼脂糖凝胶100 V电泳1.0 h，银盐染色，染色后以DL100DNA片段长度标准物为参照物，在紫外灯下判断结果并拍照。

1.6 统计学方法 用基因直接计数法计算各组人群的基因型及等位基因频率，不同人群间基因型及等位基因频率用χ2检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 eNOS基因启动子-786区基因型分析 PCR扩增产物大小为236 bp，此研究位点的T/C突变可导致限制性内切酶NgOAIV的酶切位点产生，根据酶切状况分析基因型有三种，T/T型为正常纯合子（236 bp，1条带），T/C型为突变杂合子（236、203、33 bp，共 3条带），C/C 为突变纯合子（203、33 bp，共2条带），据条带数目可以判断基因型。

2.2 两组人群eNOS基因启动子-786位点T/C多态性比较 如上多态性分布在高血压组与正常健康中老年人组的分布频率差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。

2.3 高血压各危险分组人群eNOS基因启动子-786位点T/C多态性比较 如上多态性分布在高血压各组的分布频率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.4 高血压组内按动态血压所分两组人群eNOS基因启动子-786位点T/C多态性比较 如上多态性分布在按血压节律所分两组中的分布频率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

3 讨论

对于许多原因未明的疾病人们一直渴望在基因水平发现其发病的某些相关因素。一旦某一疾病的病因在基因水平得以阐明，那么发现治疗这种疾病的最为行之有效的方式也将随之成为可能。

有统计数字表明，随着近年人们生活水平的日益提高，原发性高血压的发病率呈现上升趋势。与此同时心血管病的组成也有了改变，目前产前筛查方式的完善和抗生素的应用已使心血管病中的先天性心脏病和风湿性心脏病的比例大大减低，而人口的老龄化却使高血压性心脏病患者在心血管病中的比例大为增加。作为一种中老年人群中的常见病，原发性高血压后果较为严重，其病因一直是众多医务工作者的研究热点问题。

血管内皮不仅是血流与组织间液屏障的重要组成部分，也是血管功能重要调节因子的产地之一。血管内皮具有强大的旁分泌功能，其分泌多种血管活性物质用以调节血管的舒缩，NO就是其中较重要的一种。NO又名内皮源性舒张因子，是一种作用极强的舒张血管物质，在调节血压和维持血压稳定中起重要作用。NO可调节血管的基础张力和维持基础血压的稳定性。除此之外NO还具有强大的抗血栓作用，它可以抑制血管内皮损伤而引发的血小板聚集及黏附，可以拮抗血栓形成过程[5]。血NO水平下降是高血压患者的危险信号之一[6]。已有研究表明，原发性高血压的发生和进展与血管内皮损害、血小板激活和聚集以及各种血管炎性因子异常表达有一定相关性[7]，也就是说与NO水平的异常密切相关[8]。不仅如此，NO水平的紊乱程度还与血压自身节律性的破坏和靶器官损害有必然的相关性。因此，NO生成的限速酶基因就成了近年原发性高血压发病相关基因的研究热点。

正常情况下人体内即有一定浓度的NO存在。NO是由L－精氨酸在NO合成酶NOS的作用下产生的，是一种生物效价很高的具有广泛生物活性的信使分子。在哺乳动物中NOS主要有三种类型，分别为神经型、诱导型和内皮型。eNOS主要存在于血管内皮细胞，因而被称为内皮型NOS，是在高血压的发生发展中最有可能起作用的NO合成限速酶[9]。

表1 两组人群eNOS基因启动子-786位点T/C携带频率分布［例数及百分率（%）］

表2 高血压各危险分组人群eNOS基因启动子-786位点T/C携带频率分布［例数及百分率（%）］

表3 血压节律两组人群eNOS基因启动子-786位点T/C携带频率分布［例数及百分率（%）］

eNOS由1025个氨基酸残基组成，相对分子质量为13.3 kDa。人eNOS基因定位于染色体7q35-q36，全长21～22 kb，包括25个内含子和26个外显子。eNOS基因存在多种多态性变异，但目前研究较多的是基因启动子-786位点T/C多态性[10]。

启动子是位于编码基因上游的特异DNA序列，对于基因表达的转录水平起重要调节作用，是RNA聚合酶的结合部位，操纵着基因由DNARNA－蛋白质一级结构的启始，而这一基因区的变异将会对RNA转录有一定程度的影响，自然也会对eNOS表达产生阻碍作用，因而此基因位点变异会导致血NO水平下降也就会引发高血压病。

事实上原发性高血压的发病除与一定的遗传因素有关外，还与许多环境因素及其他诸多外因有关[11]。虽如上基因位点突变与高血压的发病有一定程度相关性，但这并不表明具有如上基因型的人就会患原发性高血压。此基因位点变异与原发性高血压患者的高血压程度及血压节律变化无关，这其中有两种可能性：其一，原发性高血压作为一种存在一定程度遗传倾向的疾病，其也一定为多基因对其发病起作用的疾病[12]，而本试验所研究的基因位点可能是与发病有关而与疾病程度无关的基因位点；其二，在原发性高血压发病的过程中，有基因水平的变异因素起作用，同时也有诸多的环境等后天因素在起作用[13]，而这些后天因素的作用在原发性高血压的程度及血压节律的存在与否上所起的作用可能更大。当然，我们所作的研究因分组较多，使得各组样本量相对较小，要得到肯定性结论仍需加大样本量进一步研究。

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Relationship between genetic polymorphism of the promoter region-786 of eNOS gene and essential hypertension

LIU Yong-sheng＊，ZHENG Li-wen，WU Guo-dong.＊Department of Cardiology，the 208th Hospital of PLA，Changchun 130062，China

Objective To detect the relationship between genetic polymorphism of eNOS gene and essential hypertension.Methods Polymorphism of the promoter region-786 T/C of eNOS gene was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism in patients with essential hypertension（n=232）and normal controls（n=130）.In hypertensive patients there were 89 patients of low risk，78 of risk and 65 of high risk.At the same time hypertensive patients were divided into dipper blood pressure group （n=109）and non-dipper blood pressure group（n=123）by the change of blood pressure rhythm.The frequencies of T/T，T/C and C/C genotype of eNOS promoter region-786 were compared in these groups.Results The frequencies of T/T，T/C and C/C genotype of eNOS promoter region-786 were 22.84%，50.87%and 26.29%in patients with essential hypertension and 36.15%，53.08%and 10.77%in normal controls.A significant difference was seen in the distribution frequency in the two groups of patients with essential hypertension and normal controls.No significant difference was seen when the risk of hypertension was increasing and the blood pressure rhythm was changing from dipper blood pressure to non-dipper blood pressure.Conclusion Polymorphism of the promoter region-786 T/C of eNOS gene has something to do with morbility of essential hypertension Genotypes T/T of the promoter region-786 of eNOS gene may have some protective effect against essential hypertension.Polymorphism of the promoter region-786 T/C has nothing to do with the extent and the change of blood pressure rhythm of essential hypertension.

eNOS； Essential hypertension； Gene； Polymorphism

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.04.007

R544.1

A

1672-5301（2014）04-0309－04

2014-02-21）