黑龙江省露地西瓜细菌性果斑病病原菌的分离与鉴定1)

贾云鹤

(黑龙江省农业科学院园艺分院，哈尔滨150069)

西瓜细菌性果实腐斑病，又称西瓜果斑病、果腐病(Bacterial Fruit Blotch，简称BFB)，是种传细菌性病害。该病害的病原菌为燕麦食酸菌西瓜亚种(Acidovoraxavenaesubsp.CitrulliWillems et al)。该病害近年来由国外传入中国，该病害发病、传播迅速，危害严重。目前国内外尚没有免疫品种，也缺乏特效的防治药剂[1]。

近年来，黑龙江省西瓜主产区果斑病爆发严重。西瓜主产区双城2009年、2010年的果斑病发病率达到70％以上，给瓜农造成了巨大的损失。针对这些情况，本试验对黑龙江地区露地西瓜的果斑病病原菌进行分离、纯化、鉴定，以期在下一步试验中根据黑龙江省西瓜果斑病病原菌的特性，找出适合防治黑龙江省西瓜果斑病的有效方法。

1 材料与方法

从黑龙江省露地西瓜主产区哈尔滨、双城、齐齐哈尔、牡丹江、佳木斯、大庆等地进行病样采集。取样部位为病瓜内表皮(西瓜皮白色的部分)。病原菌的分离、纯化方法为平板划线法。病原菌鉴定方法包括病原菌的致病性测定、病原菌的培养性状观察、显微形态观察及染色、PHB积累(类脂粒颗粒)、金氏B培养基(KBA)上荧光色素的产生、病原菌的生理生化测定(甲基红试验、V-P试验、吲哚试验)、寄主范围测定。试验方法参照方中达的《植病研究法》[2]和任欣正的《植物病原细菌的分类和鉴定》[3]。

病原菌对西瓜的致病性测定：将获得的纯培养菌株在30℃培养24～48h，制成108cfu/mL菌悬液，采用喷雾法将病原菌接种到健康无病西瓜苗上，28℃下保湿24～48h，记录出现病症的时间。接种10天之后无病症视为无致病性。

病原菌的培养性状观察、显微形态观察及染色：观察菌体形态、测定菌体大小。电镜观察菌体的显微形态。对有致病性的菌株，按一般细菌学常规方法，30℃下培养24～48h后进行革兰氏染色；

PHB积累(类脂粒颗粒)：按常规方法制成涂片后，用苏丹黑(苏丹黑B 0.3g；70％乙醇100mL)染10min，用水冲去染剂，再用二甲苯冲洗至涂片无色，然后用0.5％番红水溶液复染1～2min，水洗，吸干后镜检。

金氏B培养基(KBA)上荧光色素的产生：将病原菌接在KBA培养基上,24～48h后在波长254nm的紫外灯下检查荧光色素的产生。

病原菌的生理生化测定：甲基红试验、V-P试验、吲哚试验分别采用葡萄糖蛋白胨营养液试管、蛋白胨水培养基进行试验。

寄主范围测定：将30℃培养36h的菌株配成108cfu/mL的菌悬液采用喷雾法分别接种于健康的下列作物上：西瓜(Citrulli)、甜瓜(Cucumismelo)、黄瓜(Cucumissativus)、南瓜(Cucurbitamoschata)、西葫芦(Cucurbitapepo)、茄子(Solanumlycopersicum)、辣椒(Capsicumfrutescens)、番茄(Lycopersiconesculentum)，共8种作物。接种后28℃下用塑料薄膜保湿48h，一周后观察结果。

2 结果与分析

从黑龙江省各市县18点采样，分离出病原菌18份，病原菌的理化特性详见表1。其中8份在接种试验中对西瓜具有致病性，分别为采样自哈尔滨市黑龙江省园艺分院的H-hrb-1、采样自哈尔滨市黑龙江省红旗农场的H-hrb-2、采样自双城市周家镇的H-sc-1、采样自双城市三邻村的H-sc-2、采样自齐齐哈尔市富拉尔基区的H-qqhr-1、采样自牡丹江市宁安县的H-mdj-2、采样自佳木斯市集贤县的H-jms-1、采样自大庆杜蒙县的H-dq-1。

根据这8个菌株革兰氏染色反应阴性；显微形态为菌体杆状，大小为(2～3)μm×0.5μm，单极生鞭毛；培养性状为菌落突起，乳白色，大小为1～2mm；由此可以确定这8个菌株为食酸菌属(Acidovorax)。

根据这8个菌株能积累PHB，在KBA培养基上不产生荧光色素，可以确定两个菌株为燕麦食酸菌(Acidovoraxavenae)。

根据这8个菌株甲基红和V-P反应阴性，不能产生吲哚，能寄生在西瓜上，可以确定这8个菌株为燕麦食酸菌西瓜亚种(Acidovoraxavenaesubsp.CitrulliWillems et al)。

这8个菌株的寄主范围不尽相同，H-sc-1只在西瓜上发病，H-hrb-2只在西瓜和茄果类作物上发病。

表1 不同地点病原菌的理化特性

3 结论与讨论

3.1 通过8个对西瓜具有致病性菌株的生理生化测定，可以确定黑龙江省西瓜主产区的露地西瓜细菌性果斑病病原菌为燕麦食酸菌西瓜亚种(Acidovoraxavenaesubsp.CitrulliWillems et al)。

3.2 通过对这8个菌株寄主范围的测定，发现黑龙江省西瓜细菌性果斑病病原菌应该分两个类型：H-sc-1只和H-hrb-2为一个类型，只侵染西瓜；其他菌株为一个类型，侵染包括西甜瓜在内多种葫芦科作物和茄果类作物。这个结果和前人的研究相似：Walcott等人研究了Aac的分化现象[4]。他将世界各地56个菌株的DNA酶切处理后获得的指纹图谱进行了PFGE(脉冲电场凝胶电泳)，认为这些菌株的遗传表形已经有了分化，可以分为24个单元型。这些单元型有可分为2组：1组中菌株的寄主包括多种瓜类作物，2组中菌株的寄主全部来自西瓜。

[1]Francisco C. Q. Carvalho,et al.Selection of watermelon genotypes for resistance to bacterial fruit blotch[J]. Euphytica 2013,2(190)：169-180.

[2]方中达.植病研究法[M]. 3版.中国农业出版社,1997：156-211.

[3]任欣正.植物病原细菌的分类和鉴定[M].北京:农业出版社,1992：29-39.

[4]Walcott R. R.,et al. Role of blossoms in watermelon seed infestation by Acidovorax avenae subsp. Citrulli[J]. Phytopathology,2003,93:528-534.